Type I 限制修饰(R-M)系统分子机器的装配机制与功能研究

Type I DNA restriction-modification(R-M)system are molecular machines found in over halfbacterial genomes,including many pathogens. They restrict the influx of foreign DNA via horizontal gene transfer(HGT)into the bacterium while maintaining sequence-specific methylation modification of host DNA, and maintain the integrity of bacterial genomes. Special important in many pathogens, Type I R-M system plays a role in controlling the spread of drug resistance ,such as multidrug-resistant Staphylococcus aureus(MRSA),where the Sau1 type I R-M system appears to regulate HGT. An important goal in understanding Type I R-M system -- The large molecular machines is determination of their molecular architecture,as this provides the foundation for understanding their mechanism. Type I R-M enzymes is a complex oligemer formed from a core methyltransferase(MTase)comprised one HsdS DNA Specificity subunit and two HsdM DNA Modification subunits, M2S1, with a total molecular weight of -160kDa.This is complexed with two additional HsdR DNA Restriction subunits,giving a complex R2M2S1 with a total molecular weight of 440kDa that is capable of functioning as both MTase and restriction endonulease. The overall crystal structure is not known for either the MTase or the complete R-M complex althrough several models have been proposed.The absence of these structures has hindered study of Type I R/M enzymes but their enduring appeal as research targets is due to their extraordinary complexity of operation. This project aims to resolving the three dimensional structrue of M2S1, M2S1-DNA, and Type I restriction/modification enzymes M2R2S1 complexes by X-ray crystallographic method, combined with biochemistry, molecular biology research on function, to further explore the relationship between structure and function. Through these work, reveal the molecular architecture and action mechanism of Type I R-M molecular machines, to further clarify the molecular mechanism of block HGT, and lay the foundation for the genetic engineering development in the control of pathogenic bacteria acquired antibiotic resistance.

Type I 限制修饰（R-M）系统是细菌的重要分子机器。它通过对寄主DNA特异序列的识别与甲基化修饰限制外源DNA依赖水平基因转移（horizontal gene tranfer，HGT）侵入寄主染色体，从而保证遗传的稳定性。特别是在控制致病菌耐药性的产生和变迁方面起到了关键作用。.因此，测定这个分子机器的结构和组装方式是研究其作用机理的根本。但是，目前还没有关于Type I R/M系统亚基的二元、三元复合物晶体三.维结构的报道。本项目旨在通过X-ray 晶体学方法解析Type I DNA甲基转移酶 M2S1、M2S1-DNA复合物、以及限制修饰酶M2R2S1的三维结构，并结合生物化学、分子生物学开展功能研究，进一步探讨结构和功能的关系。通过这些工作，揭示Type I R/M 分子机器的装配与作用机制，为.阐明其阻碍HGT的分子机理，控制致病菌获得抗生素抗性的遗传工程与应用奠定基础。

Type I 限制修饰（R-M）系统是细菌的重要分子机器。它通过对寄主DNA特异序列的识别与甲基化修饰限制外源DNA依赖水平基因转移（horizontal gene tranfer，HGT）侵入寄主染色体，从而保证遗传的稳定性。特别是在控制致病菌耐药性的产生和变迁方面起到了关键作用。因此，测定这个分子机器的结构和组装方式是研究其作用机理的根本。但是，目前还没有关于Type I R/M系统亚基的二元、三元复合物晶体三维结构的报道。本项目旨在通过解析Type I DNA甲基转移酶 M2S1、M2S1-DNA复合物、以及限制修饰酶M2R2S1的三维结构，并结合生物化学、分子生物学开展功能研究，进一步探讨结构和功能的关系。通过这些工作，揭示Type I R/M 分子机器的装配与作用机制，为阐明其阻碍HGT的分子机理，控制致病菌获得抗生素抗性的遗传工程与应用奠定基础。.1．TypeI R-M系统由多个亚基组成，包括DNA识别S-亚基、甲基化M-亚基和限制性内切酶 R-亚基。至今还未有EcoKI HsdS 亚基的三维结构报道，我们在2011年成功解析来源于古细菌TTE的S亚基的基础上，运用 Hg 原子衍生物SAD方法解析了来源EcoKI HsdS 亚基2.5 Å 的三维结构。基于结构分析和生化实验，我们提出了大肠杆菌 EcoKI Type I 甲基转移酶 M2S1 闭合态与开放态转换的动态模型。 .2．Type I R-M系统是最早被发现却又是最为复杂的R-M系统。Type I甲基转移酶包含一个DNA识别亚基（HsdS）和两个甲基化亚基（HsdM）。大肠杆菌EcoKI-M2S1的电镜模型展示了Type I甲基转移酶的闭合状态，目前还没有关于其开放态模型的报道。首次报道了TypeI系统中MTase复合物（2M+1S）在小分子SAM存在条件下与双链DNA的四元大复合物“Open”模式的3.2 Å的晶体三维结构。基于结构与生化实验分析，我们提出了Type I R-M分子机器组装的新模型。这对于深入理解细菌抵御病毒入侵的Type I R-M系统的分子机制具有重要的意义，这一工作为TypeI限制修饰系统今后在分子生物学中的应用提供了有力的结构和理论依据。.3．此外，我们解析了Type I R-M系统R2M2S1与DNA、ATP、SAM 分子机器原子分辨率的三维结构，工作正在整理投稿。