HBsAg上调慢性乙肝患者树突状细胞PD-L1表达的机制研究

Host immune dysfunction against hepatitis B virus (HBV) is an important cause of chronic HBV infection. Previous studies have demonstrated that PD-L1 expression on dendritic cells (DC) of patients with chronic hepatitis B was significantly up-regulated and could induce HBV-specific CTLs exhaustion through PD-1/PD-L1 signaling pathway which was an important mechanism leading to persistent HBV infection. However, it is not clear which signaling pathway is involved in induction of DC PD-L1 up-regulation during chronic HBV infection. Our preliminary study have found that hepatitis B surface antigen (HBsAg) could up-regulate PD-L1 expression on DC, but the exact molecular mechanism is unknown. In this project, our aim is to clarify the specific molecular mechanism of HBsAg induced PD-L1 up-regulation on DC using Chromatin Immunoprecipitation, Western blot, siRNA techniques and the effects of PD-L1 blocking on HBV-specific CTLs function. This study may provide a theoretical basis for the development of new treatments for intervention of PD-L1 expression on DC of chronic hepatitis B.

机体针对乙型肝炎病毒（HBV）免疫功能受损是导致HBV感染慢性化的重要原因。研究证实慢性乙肝患者体内树突状细胞(DC） PD-L1表达显著上调，可通过PD-1/PD-L1信号通路诱导HBV特异性CTLs功能耗竭，是导致HBV持续感染的重要机制之一。然而，目前并不清楚HBV慢性感染导致DC PD-L1表达上调的具体信号通路。我们前期研究发现乙肝表面抗原（HBsAg）可显著上调DC PD-L1表达，但其具体分子机制不详。本课题拟应用染色质免疫共沉淀，Western blot，siRNA等技术阐明HBsAg上调DC PD-L1表达的具体分子机制及不同方式阻断PD-L1表达后对HBV特异性CTLs功能的影响，为下一步开发干预慢性乙肝患者DC PD-L1表达的新型治疗药物提供理论依据。

机体针对乙型肝炎病毒（HBV）免疫功能受损是导致HBV感染慢性化的重要原因。研究证实慢性乙肝患者体内树突状细胞(DC）PD-L1表达显著上调，可通过PD-1/PD-L1信号通路诱导HBV特异性CTLs功能耗竭，是导致HBV持续感染的重要机制之一。本研究建立了人树突状细胞体外规范化培养系统。发现：(1) MACS磁珠分选法培养DC的纯度高于普通贴壁法。对于40-50万CD14+单核细胞/mL，诱导未成熟DC所需的GM-CSF适宜浓度为600-1000 U/mL，IL-4适宜浓度为500 U/mL，相应的促成熟因子IL-1β，IL-6，TNF-α的浓度均为1000 U/mL，R848为5 μg/mL，PGE2为1μg/mL；(2) GM-CSF/IL-4诱导获得的未成熟DC低表达成熟标志CD83，中度表达CD40, CD80, CD86, CD274, CD1a和HLA-DR。HBV抗原肽（HBV Core 18-27，HBV Surface 172-181，HBV Surface 185-194，HBV Polymerase 573-581，HBV Envelope 183-191）促DC成熟能力很弱。(3) 促成熟方案IL-1β，IL-6，TNF-α加PGE2或R848加PGE2促成熟2天后，DC高表达CD83至少可以维持2天，并且有很高的存活率。(4) 促成熟方案IL-1β，IL-6，TNF-α加PGE2或R848加PGE2促成熟2天的DC均可产生较高水平IL-12p40，相比IL-1β，IL-6，TNF-α加PGE2促成熟DC，R848加PGE2促成熟DC产生较高水平IL-12p70。(5) R848加PGE2促成熟DC表达趋化因子受体CCR7的水平高于IL-1β，IL-6，TNF-α 和PGE2促成熟DC，而表达PD-L1的水平（MFI）较低。(6) 负载HBV抗原肽的未成熟DC经IL-1β，IL-6，TNF-α加PGE2或R848加PGE2促成熟后，均可刺激HBV特异性CTL增殖，其中表达PD-L1水平较低的成熟DC刺激HBV特异性CTL增殖的能力较强。上述结果证实了成熟DC高表达PD-L1对HBV特异性CTL的产生有抑制作用。我们的研究工作阐明了PD-1/PD-L1在HBV感染慢性化中具有重要作用，为慢性乙肝的免疫治疗开辟新的思路，提供了新的干预靶标。