慢性乙肝患者CD4+CD25+T细胞在外周血树突状细胞成熟及抗原提呈中的作用

慢性乙肝患者树突状细胞（DC）成熟及功能障碍,不能产生有效的针对HBV特异性细胞毒性T细胞（CTL）反应的确切机制尚不清楚，而慢性乙肝患者外周血CD4+CD25+T细胞（Treg）可以抑制CTL功能，进而在免疫耐受中发挥作用，因此，我们推测Treg对DC成熟及抗原提呈功能可能会产生影响。本课题拟选取不同免疫状态慢性乙肝患者，将其外周血单核细胞在体外接受含有HBV-C的重组腺相关病毒刺激后，观察Treg细胞对DC成熟及抗原提呈功能的影响，同时观察去除Treg细胞及加入相应抑制其活化的抗体后，DC功能和CTL杀伤活性的改变。此外，通过小干扰RNA的方法抑制慢性乙肝患者Treg细胞中叉头状螺旋转录因子（Foxp3）的表达，探讨Foxp3对其活化的影响。本研究旨在揭示不同免疫状态慢性乙肝患者Treg细胞对DC成熟及抗原提呈的作用机制，并为以Treg细胞为靶向的免疫治疗提供一定实验室基础。

本室前期研究发现：虽然在体外经抗原刺激后慢乙肝患者DC的功能有所提高，但还是不能完全打破免疫耐受，因此我们推测慢性乙肝患者体内Treg细胞可能对DC的成熟及抗原提呈功能产生影响。本研究首先构建AAV/HBV-C质粒载体，并将其包装成重组AAV/HBV-C病毒；将此重组病毒分别感染慢乙肝患者及正常人外周血单核细胞,观察其在体外GM-CSF、IL-4和AAV-HBV-C共刺激下，对于DC成熟的影响。第二，分别选取慢性乙肝患者及正常人群各20例为研究对象，分离外周血单核细胞体外培养；同时体外分离Treg细胞和CD4+CD25-T细胞，在DC体外培养第4天进行Treg/CD4+CD25-T细胞与DC的混合培养，观察Treg细胞和CD4+CD25-T细胞对单核细胞来源的DC成熟的影响。结果证实：相比于CD4+CD25-T细胞，正常人群中Treg细胞显著抑制了DC成熟标志CD80,CD86及CD83的表达（分别下降8%，8.2%和14%），慢性乙肝患者组这种抑制作用更强：相比于CD4+CD25-T细胞， Treg细胞显著抑制了DC成熟标志CD80,CD86及CD83的表达（分别下降11%，9%和16%）；第三，设计并合成针对FOXP3最有效的siRNA-FoxP3，通过高效转染试剂将其转染Treg细胞，观察其对Treg细胞刺激同源CD4+CD25-T细胞增殖能力的影响。以EntransterTM-R5高效转染原代Treg细胞（转染效率可达72.24±1.26%），证实化学合成的长效siRNA-FoxP3转染Treg后可有效降低其对同源CD4+CD25-T细胞增殖能力的抑制作用：相比于未转染组，增殖指数上调27.8%。.在本研究中我们应用AAV/HBV-C病毒分别感染慢乙肝患者及正常人外周血单核细胞，证实其对DC成熟表面标志物的表达未见明显影响；通过优化培养条件证实：相比于CD4+CD25-T细胞，Treg细胞显著抑制了DC成熟标志CD80,CD86及CD83的表达，而慢性乙肝患者组这种抑制作用更强；通过优化转染条件，以EntransterTM-R5转染原代Treg细胞，证实化学合成的长效siRNA-FoxP3转染Treg后可有效降低其对同源CD4+CD25-T细胞增殖能力的抑制作用，为进一步临床应用于慢性乙肝病人提供研究基础。