L型丙酮酸激酶与非酒精性脂肪肝的相关性及其机制研究

非酒精性脂肪肝(NAFLD)严重危害人类健康,肝脏糖异生是NAFLD发生的机制之一，L型丙酮酸激酶(LPK)是糖异生逆反应-糖酵解的关键限速酶之一,基因连锁和关联分析显示该基因与肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关。本课题组前期研究发现LPK在NAFLD模型中表达显著降低,启动子区的DNA甲基化异常是其表达下调的重要机制；在脂肪肝细胞模型中LPK基因过表达和RNAi,均能够相应改变脂肪肝的脂肪含量及胰岛素抵抗状态。为了进一步研究LPK在NAFLD中的作用及其机制，本课题拟在临床NAFLD样本中验证LPK与NAFLD的相关性；研究LPK基因在NAFLD中的表达调控元件及其表观遗传机制；探索LPK 基因过表达对NAFLD小鼠的治疗作用；在此基础上，围绕糖脂代谢和胰岛素信号转导通路阐明LPK治疗NAFLD的分子机制。该研究对NAFLD的致病机制的阐明以及NAFLD的预防和治疗具有重要意义。

非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）严重危害人类健康。丙酮酸激酶基因（L-type pyruvate kinase，LPK）是糖酵解通路中的关键基因之一，多个关联研究结果都显示LPK 基因和非酒精性脂肪肝的发生有显著相关性，为此，我们在国家自然基金（81170786）的资助下，开展了LPK与NAFLD相关性及其分子机制研究，重点在NAFLD 模型中开展了LPK 基因表观遗传学研究。.首先，通过棕榈酸（palmitic acid，PA）诱导大鼠肝脏细胞（BRL）制备了NAFLD细胞模型，通过高脂饮食喂养SD 大鼠建立了NAFLD 大鼠模型。在此基础上，该课题从DNA 甲基化，组蛋白乙酰化和miRNA 调控三方面研究NAFLD 模型中表观遗传学修饰对LPK 基因表达的影响：1. 两种NAFLD 模型中LPK 基因启动子区域CpG 位点的甲基化程度显著高于正常对照组（P<0.05）。2. 染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）实验发现两种NAFLD 模型中LPK 基因DNA 区域组蛋白H3、H4 的总体乙酰化程度均显著低于对照组（P<0.01）。 3. miR‐15b 可能是潜在的血清标志物。miR‐15b 表达量在NAFLD 细胞和动物模型中都显著升高（P<0.01）。在我们收集的37 例健康人和64 例脂肪肝患者的血清中，发现脂肪肝患者血清中miR-15b 的表达量显著高于（P<0.01）健康人。.该课题还采用CRISPR基因编辑技术，构建LPK敲除小鼠，检测发现其丙酮酸激酶活性显著下降，并出现了脾脏肿大的现象，在小鼠肝脏、肌肉和脂肪组织中的糖脂代谢相关基因定量显示：小鼠组织脂肪合成能力基因表达下降，代谢能力基因表达增强，能够合成更多的葡萄糖，此外还反映出小鼠白色脂肪向褐色脂肪转化，从而更快的向组织提供能量，肌肉组织中出现了炎症反应。.该课题首先通过细胞模型和实验动物（小鼠和大鼠）阐明了LPK在糖脂大写和NAFLD中发挥的重要作用，并重点从表观遗传学的三个方面：DNA 甲基化、组蛋白乙酰化和miRNA 调控初步探索了LPK 基因在NAFLD 模型中表达调控机制， BBR 治疗NAFLD的机制之一可能是通过逆转其表观修饰从而恢复LPK 基因表达，改善糖脂代谢，该