利用Avy小鼠模型研究胚胎玻璃化冷冻对DNA甲基化修饰及相关疾病易感风险的影响

In recent years,embryo vitrification technology has been gradually applied in the field of assisted reproduction at home and abroad,but it is not clear whether the freezing process can cause DNA methylation changes of the early embryos or affect the potential disease risk of the offsprings. This project will utilize Avy mice model whose coat color changes can intuitively reflect the extent of DNA methylation. Embryos are operated respectively by vitrification and non-freezing. The impact of embryo vitrification on DNA methylation will be analyzed by observing the coat color changes of Avy/a posterity mice and detecting the methylation levels in Avy gene promoter region among different coat color mice compared with that in vitrification and non-freezing early embryos.The risk of disease susceptibility for embryo vitrification will be assessed by comparing the incidences of Spontaneous and induced susceptible diseases(obesity, diabetes and tumor) among different groups, from which the potential hazard of embryo vitrification to the progeny individuals will be analyzed. Furthermore, we will explore the relationship between the expression of DNA methyltransferase and the methylation levels of disease associated key genes in the early embryos. The molecular mechanism of DNA methylation affected by embryo vitrification and the disease susceptibility potential risk of the offspring will be discussed, which will provide us with scientific principles for the safety assessment and technology improvement of the human embryo vitrification.

胚胎玻璃化冷冻技术近几年在国内外辅助生殖领域得到逐步的推广，但其冷冻过程是否会引起早期胚胎DNA甲基化的改变并影响出生后代潜在发病风险目前仍不清楚。本项目将利用一种能通过毛色变化直观反映DNA甲基化程度的Avy小鼠模型，分别进行胚胎玻璃化冷冻和非冷冻操作，观察后代Avy/a小鼠毛色的变化，检测不同毛色小鼠Avy基因启动子甲基化状态，并对比玻璃化冷冻和非冷冻胚胎中该基因甲基化水平分析胚胎玻璃化冷冻对DNA甲基化的影响。通过观察后代小鼠自然发生以及经诱导后发生易感疾病（肥胖、糖尿病和肿瘤）的情况，评估胚胎玻璃化冷冻出生小鼠的疾病易感风险及其对后代个体的潜在危害程度。进一步检测胚胎中DNA甲基转移酶的表达及其与致病关键基因甲基化水平的关系，验证其发生机制，阐明胚胎玻璃化冷冻对DNA甲基化的影响及其对后代疾病易感的潜在风险和相关分子机制，为人类胚胎玻璃化冷冻的安全性评估及技术改良提供科学根据。

辅助生殖技术近几年在国内外发展迅速，帮助许多不孕不育的妇女成功怀孕。然而，辅助生殖技术的操作过程包括体外授精，体外培养和玻璃化冷冻对胚胎发育及其表观遗传学的影响以及对出生后代潜在发病风险的影响目前仍不清楚。本课题利用一种能通过毛色变化直观反映DNA甲基化程度的Avy小鼠模型，分别进行体外授精和胚胎玻璃化冷冻操作，观察后代小鼠毛色的变化，结果发现体外授精-新鲜胚移植组和体外授精-冷冻胚胎移植组出生后代中Avy/a小鼠的毛色分布与自然出生组相比发生改变。黄毛小鼠的比例显著高于自然出生组，而棕毛小鼠的比例显著低于自然出生组，但是鲜胚移植组和冻胚移植组之间没有差别。此外，3组中Avy/a和a/a小鼠的比例无明显改变。跟踪比较各组间出生后代体重，结果没有发现明显差别，但是每一组中Avy/a小鼠体重均显著高于a/a小鼠。进一步检测各组出生后代中不同毛色小鼠Avy基因启动子甲基化水平，结果表明体外授精-新鲜胚移植组和体外授精-冷冻胚胎移植组出生后代Avy基因的总甲基化水平显著高于自然出生组,但是鲜胚移植组和冻胚移植组之间没有差别。以上结果表明，玻璃化冷冻没有影响Avy小鼠出生后代的毛色分布以及Avy基因的甲基化水平，但是体外授精会改变Avy小鼠出生后代的毛色分布并降低Avy基因的甲基化水平。以上结果提示体外授精可能会影响小鼠胚胎发育和出生后代的表观遗传改变。这将为人类辅助生殖技术的安全性评估及技术改良提供科学根据。此外，我们研究发现胚胎长期体外培养会增加小鼠囊胚异常孵化的发生。体外培养和体外受精组的8字形型囊胚孵化率显著高于体内发育组。进一步通过免疫荧光染色证明这种8字孵化可以导致内细胞团发生分裂从而形成双内细胞团。以上结果提示长期的体外培养可能会增加同卵双生的发生风险。该研究成果发表于plos one 杂志（IF:3.2）。