基于神经递质假说研究苦碟子和灯盏细辛治疗缺血性脑卒中的共同分子机制

Cerebral ischemic stroke (CIS) is a common cardio-cerebral vascular disease which does serious harm to human's life and health. Herbs which can detoxicate, activate blood circulation and dredge collaterals such as Ixeris sonchifolia Hance and Erigeron breviscapus play an important role in treating CIS with toxin damaging brain collaterals theory in Chinese medicine. Neurotransmitter pathway is found to be the common regulatory pathway of various nervous system disease including CIS, which pathogenesis is complicated. Preliminary tests have shown that Ixeris sonchifolia Hance can correct exceptions in neurotransmitter emission of MCAO/R model rats. Based on this, we put forward the idea that herbs which can detoxicate, activate blood circulation and dredge collaterals may cure CIS by regulating exceptions in neurotransmitter emission. However, such regulatory pathway of herbs remains unclear with 20 neurotransmitters and 140 regulatory proteins involving in pathogenesis of CIS. The present study take Ixeris sonchifolia Hance and Erigeron breviscapus as example, to search the common molecular mechanism that herbs which can detoxicate, activate blood circulation and dredge collaterals act on CIS by using quantitative proteomics.

缺血性脑卒中（CIS）是严重危害人类健康的常见病。“毒损脑络”指导下的解毒通络活血中药（苦碟子、灯盏细辛等）在中医药防治CIS中占有重要地位。CIS发病机制复杂，其中神经递质通路正成为CIS在内的多种神经系统疾病的共同调控途径。前期试验发现苦碟子能够调控缺血再灌注模型大鼠神经递质的异常释放，我们提出“对神经递质异常释放的调控可能是解毒通络活血类中药治疗CIS的共同分子机制”的设想。但是，与CIS发病机制相关的神经递质有20多个，参与其异常释放的调控蛋白多达140个，解毒通络活血类中药治疗CIS的共同调控途径尚未清楚。本项目以苦碟子和灯盏细辛为例，运用定量蛋白质组学技术对二药调控神经递质异常释放的相关蛋白进行系统分析，并对获得的靶蛋白进行多层次验证，从而明确其治疗CIS的共同分子机制。本项目能够为解毒通络活血类中药治疗CIS的共同分子机制的阐释及特异性分子靶标的寻找提供科研方法与实验依据。

为阐释苦碟子和灯盏细辛干预缺血性脑卒中作用及神经递质异常释放的调控机理，本项目采用MCAO/R大鼠模型，通过神经功能评分、TTC染色法观察脑梗死体积、HE染色评价神经细胞形态等进行模型评价和药效研究。在此基础上，研究了急性期（6h、12h和24h）模型组中脑组织的差异代谢物及代谢物类型转变规律，开发和建立了基于高分辨质谱的平行反应检测技术（PRM）的神经递质检测平台，并通过质谱成像技术进一步确证，发现苦碟子及灯盏细辛对脑卒中神经递质的干预作用。通过稳定性同位素标记的iTRAQ蛋白质组学技术（用于苦碟子研究）、非标定量（label-free）蛋白质组学和PRM定量蛋白质组学技术，从多个技术层面全面表征苦碟子和灯盏细辛干预MCAO/R模型大鼠的蛋白质谱的轮廓变化。进一步明确神经递质的生成、释放及再摄取是苦碟子和灯盏细辛药效作用的重要机制。.为了深入探讨苦碟子和灯盏细辛发挥药效的有效成分，进一步表征了二药所含化学成分的体内外含量及代谢分布情况。其中体外表征了苦碟子80余种化学成分，经体内代谢共鉴定了23种化学成分，并明确了这些成分在血（23种）、脑（13种）、心（12种）、肝（20种）中的分布。基于上述研究结果，我们选取了苦碟子中9种入脑活性成分以及灯盏细辛中的灯盏花素进一步开展药效和作用机制研究。.研究结果发现苦碟子及其有效成分通过对WNT5A蛋白的干预，经由PKA及PKC两大信号转导系统，对GLYT1，SERT，EAAT1，EAAT2， VAMP1， RAB3A，SNAP25，NFAT4等多个功能蛋白产生了显著影响，实现对神经递质释放及再摄取的精准调控。同时，通过对BCL-2，CASPASE-3，NFKB-1等效应蛋白进行表征，综合荧光钙成像结果及对NMDAR蛋白的下调作用，明确苦碟子及其有效成分通过抑制神经兴奋性毒性对神经细胞的凋亡产生抑制作用。在对灯盏细辛有效成分灯盏花素的机制研究中， 通过PRM定量蛋白质组学技术对谷氨酸能兴奋性神经递质的调控进行验证研究，同样发现中药对神经兴奋性毒性有效抑制。结果显示NMDA受体亚型Grin1、Grin2b；AMPK受体Gria2、Gria3；KA受体Grik2、Grik5和代谢型受体Grm1都产生了明显的表达变化。