美洲大蠊提取物对肝星状细胞生物行为和肝纤维化进程干预的分子机制

慢性肝损伤中肝星状细胞(HSC)表型转变和血管新生是肝纤维化间质重建突出的病理特征。星状细胞活化增殖，细胞外基质增加，窦周新生血管分流和门静脉阻力增加是肝损伤持续和门脉高压发展的基础。活化星状细胞同时参与血管新生和纤维发生，是肝纤维化基质重建的细胞学基础。美洲大蠊提取物(PAE)有促进组织修复、改善微循环、抑制血管新生形成等作用。前期研究发现PAE能抑制肝星状细胞的促血管新生作用，减轻硫代乙酰胺(TAA)诱发的大鼠肝纤维化，但机制不明。通过分离和培养大鼠肝星状细胞、骨髓间充质干细胞，在细胞和分子水平研究美洲大蠊的水和醇提取物对活化星状细胞增殖、迁移、凋亡、促血管新生因子表达等生物行为的影响，促血管形成的干预及其分子机制。通过硫代乙酰胺和胆总管结扎(BDL)诱发大鼠慢性肝损伤，探讨美洲大蠊提取物对肝纤维化进程的影响和可能的细胞分子机制，为美洲大蠊提取物抗肝纤维的有效性和安全性提供实验证据。

目的：研究美洲大蠊提取物（PAE）对肝脏间质细胞表型转变和生物行为的影响，探讨美洲大蠊提取物对肝纤维化间质重建影响及细胞分子机制。.方法： 体外研究：在体灌洗和离体后胶原酶、链蛋白酶消化大鼠肝脏，11% Nycodenz和Pecoll密度梯度离心，选择性贴壁分离出大鼠肝星状细胞（HSC）和肝窦内皮细胞（SEC）；细胞免疫荧光染色和Matrigel血管生成实验对HSC和SEC进行鉴定；用不同浓度的PAE对体外活化HSC进行干预，观察对细胞增殖的影响; 测定细胞上清液中低氧诱导因子-1（HIF-1a）和细胞外基质的变化；在核酸和蛋白质水平分析a-SMA、整合素avB3在干预后的表达变化；细胞划痕和Transwell 分析PAE对HSC迁移的影响；观察PAE对SEC在Matrigel上形成血管腔样结构的变化。体内研究：72只雄性SD大鼠，随机分为正常对照组，硫代乙酰胺（TAA）模型(175mg.kg-1,每周2次腹腔注射)加10% 2ml PAE灌胃干预组，硫代乙酰胺模型对照组，胆总管结扎（BDL）模型加PAE干预组，胆总管结扎模型对照组和假手术组6组；在硫代乙酰胺建模8周和胆总管结扎3周末处死大鼠，测定血清中转氨酶和纤维标志物水平；纤维染色观察肝脏间质改建情况；荧光染色观察间质重建中血管标志物CD31、vWF的表达；免疫组化染色，核酸和蛋白质水平分析HIF-1a、整合素avB3在各组的表达。.结果：成功分离和体外激活HSC，SEC在Matrigel能形成血管腔样结构，PAE能抑制HSC增殖，最适宜的抑制浓度为5ug/ul；PAE干预组中HIF-1a、HA、LN和IV-C等水平下降（P<0.01）；PAE下调HSC中a-SMA、整合素avB3的表达(P<0.05)和抑制SEC形成血管腔样结构（P<0.05），减弱HSC的迁移能力（P<0.01）；2种肝纤维化模型中，PAE干预组纤维标志物低于模型对照组（P<0.05）, PAE干预组中纤维程度较与对照组减轻（P<0.05）； 与对照组比较，PAE干预组HIF-1a、整合素avB3的表达水平下降（P<0.01）。.结论：PAE降低HSC分泌HIF-1a和下调整合素avB3表达，削弱HSC的增殖、移动、收缩和抑制SEC的活化表型。肝纤维化间质改建中PAE下调HIF-1a和整合素avB3的表达降低病理性血管新生的形成，延缓