苹果砧木平邑甜茶GA20-氧化酶基因沉默的效应及沉默信号的嫁接传递性

砧木影响接穗生长发育的机制非常复杂，最近的研究表明一些介导基因沉默的小RNA（small RNA)可以从砧木运输到接穗，产生系统获得性沉默。基因系统获得性沉默理论为果树砧木基因工程育种提供了全新的思路，即将编码沉默信号的基因导入砧木当中，当非转基因接穗品种嫁接到转基因砧木上以后，砧木产生的小RNA分子可以运输到接穗，导致接穗性状改变。嫁接是苹果最主要的繁殖方式，矮化是苹果栽培的发展方向。本项目拟以无融合生殖的苹果砧木- - 平邑甜茶为试材，比较分析hpRNAi技术和人工microRNA技术沉默苹果GA20-氧化酶基因产生的生物学效应，揭示siRNA和amiRNA两种沉默信号分子从苹果砧木向接穗传递的可能性及长距离运输能力，探讨影响小RNA嫁接传递性的主要因素。本研究旨在建立全新的苹果砧木分子育种技术体系，揭示基于系统获得性沉默原理利用转基因苹果砧木改良非转基因苹果接穗的可行性。

砧木影响接穗生长发育的机制非常复杂，已有研究表明一些介导基因沉默的小RNA（small RNA)可以从砧木运输到接穗，产生系统获得性沉默。基因系统获得性沉默理论为果树砧木基因工程育种提供了全新的思路。本项目基于小RNA介导的基因沉默开展培育苹果矮化砧木的研究，主要研究内容和结果如下：（1）采用同源克隆策略，利用RT-PCR技术从苹果属植物‘平邑甜茶’（Malus hupehensis var. pingyiensis）苹果（M. domestica）栽培品种‘寒富’中克隆出GA合成关键酶GA20-氧化酶的基因全序列，选取序列保守的466bp基因片段进行RNAi载体的构建，并利用农杆菌介导的遗传转化技术将GA20-氧化酶的RNAi基因分别导入‘平邑甜茶’（获得12个转化试管苗株系）和‘寒富’（获得5个试管苗转化株系）。（2）以拟南芥miR169d前体序列为骨架，构建了针对苹果GA20-氧化酶基因的能够产生长度为21nt小RNA的人工miRNA载体。分析了植物不同miRNA序列和前体结构特性，推测出拟南芥miR163前体是产生24nt人工miRNA的合适骨架，在此基础上分别构建了针对苹果GA20-氧化酶基因的旨在产生长度为24nt小RNA的人工miRNA载体。（3）在转人工miRNA基因的苹果植株中能够检测到人工miRNA，但是表达水平较低，试管苗植株也未表现明显的矮化表型；转RNAi基因的苹果试管苗植株均表现出明显的矮生表型，转基因株系的株高是非转基因对照的47%-82%，GA20氧化酶基因转录本水平是对照的5%-60%，GA含量为对照植株的52%-66%。（4）转RNAi基因的苹果植株在田间移栽成活，但是植株生长非常缓慢、节间长度显著短于非转基因植株，喷GA3后，转基因植株的节间明显伸长，与非转基因植株没有差异。（5）试管苗微嫁接结果表明，转RNAi基因的苹果植株具有致矮效应。（6）建立了以苹果子叶为外植体进行苹果基因功能验证的遗传转化体系，选育出具有高再生能力且对农杆菌敏感的苹果基因型GL-3，将苹果的遗传转化效率提高了十倍以上。本研究结果揭示了利用RNAi技术培育苹果矮化砧木的可行性。本项目发表论文5篇，其中在SCI源期刊发表论文3篇。