红树林污泥中海洋高效产氢细菌成团泛菌的产氢机理研究

本项目以从红树林污泥中分离获得的海洋高效产氢菌株成团泛菌BH-18为研究对象，采用抑制性差减杂交的方法，构建菌株BH-18产氢阶段与非产氢阶段的抑制性差减cDNA文库，筛选出一批与产氢代谢相关的基因；在此基础之上，采用实时定量PCR方法分别对该些基因在菌株BH-18产氢过程中的表达量变化进行监测，挑选一批表达量变化较大的关键性酶和调控蛋白基因；然后，采用染色体步移的方法克隆分别获得基因全序列，并对其序列进行分析；最后将编码功能区域的基因片段连接到原核表达载体，转化入菌株BH-18，采用间歇产气试验检测重组菌的最大产氢量和产氢速率的变化，确定各基因在产氢代谢中的作用。该项目的完成将系统地揭示产氢相关基因在成团泛菌产氢代谢中的作用，在分子水平上对暗发酵细菌产氢机理进行研究，其研究成果将为暗发酵产氢的分子调控和高效产氢基因工程菌株的开发研究提供理论依据。

微生物暗发酵产氢是最具发展前景的生物制氢方法，其工业化面临的最大问题是产氢效率不高，为实现产氢效率的提高，先需明确产氢微生物的产氢机理。本研究以高效产氢菌株成团泛菌BH-18和混合菌TM为研究对象，分别从基因组学、蛋白质组学和发酵产物分析三个层面来研究其产氢代谢路径。.成团泛菌BH-18发酵产物分析表明其发酵类型属于混合酸发酵。基因组学研究表明成团泛菌基因组大小约为5.11Mb，GC含量为55.04%，预测编码基因3,579个，检测到114个重复序列，重复长度为8,279bp。基因组预测蛋白中存在甲酸氢裂解酶，该酶是混合酸发酵的关键酶。通过双向电泳技术与质谱分析相结合，研究了该菌的蛋白质组学，最终获得了产氢不同时期共六类差异蛋白，对这些蛋白进行分析，表明除了混合发酵产氢以外还存在另一条产氢路径——固氮产氢，并且糖酵解途径和磷酸戊糖途径也参与了产氢。.混合菌TM由TM-a和TM-b两种细菌组成，两种细菌非常难分离，但是产氢量很高。发酵产物分析表明其发酵类型包括混合酸发酵和丁酸发酵两种。TM-a基因组学研究表明其基因组大小约为5.9Mb，GC含量为54.88%，预测编码基因4,291个，检测到61个重复序列，重复长度为7,564bp。TM-a基因组预测蛋白中存在固氮酶，这表明产氢存在另一条途径——固氮作用。TM-b基因组学研究表明其基因组大小约为6.5M，GC含量为31.91%，预测编码基因5,080个，检测到2,328个重复序列，重复长度为104,374bp。蛋白质组学研究获得了四类差异蛋白，其中铁氧还蛋白是丁酸发酵产氢中的关键蛋白。