低丰度S-酰化修饰细胞膜蛋白高效富集并准确定量新方法及其在肝炎中的应用研究

Proteins S-acylation plays very important roles in cell signaling, apoptosis and disease. The current "cysteine-centric" approaches which rely on the labile disulfide bonds, suffer from tedious procedures and a relatively high false positive rate. Furthermore, such methods are not suitable for qualitative and quantitative analysis of the low abundant and hydrophobic peptides. Here, based on our previous work, the project aims at designing a novel magnetic nanomaterial, which is modified with stable isotopic tags and thiol-specific reactive groups, and developing a new method to enrich effectively, identify correctly and quantify accurately the low abundant S-acylated plasma membrane proteins. The special reactive groups on the materials can be used to enrich specifically the S-acylated peptides, which can reduce the false positive results. The enrichment capacity and efficiency can be enhanced greatly because of its nanometer size and larger surface area. The magnetic core can afford the isolation of target peptides quickly and conveniently. The enriched S-acylated peptides can be eluted from the nanomaterials by the acid labile sites. The stable isotopic tags can be used to identify correctly and quantify accurately peptides in the LC-MS analysis. Finally, we will use this newly developed method to gain insight into the mechanism of S-acylation in the HCV replication.

S-酰化修饰在细胞信号传导、凋亡和疾病发生中都具有重要作用。针对现有"以半胱氨酸为中心"方法的不足：以"二硫键"为断裂键，操作繁琐，假阳性率高，不利于丰度低疏水性强的肽段鉴定和定量分析等，本研究拟在前期工作的基础上，设计一种带稳定同位素标签且能与巯基特异反应的新型磁性纳米材料，建立低丰度S-酰化修饰细胞膜蛋白质高选择性富集和高正确鉴定并可实现准确定量的新方法：利用材料的特殊反应基团实现S-酰化修饰肽段的特异富集，减少"假阳性"结果；利用"纳米尺寸"大的比表面积，可增大富集容量，实现高效富集；利用它的磁核心实现快速、简便地分离；利用它的酸解位点实现富集后肽段的洗脱；利用它的稳定同位素标签实现质谱的正确鉴定和准确定量。最后将该法用于HCV复制机理的研究中。

蛋白质是生命活动的体现者，其表达量与翻译后修饰状态会影响蛋白质的结构和功能。因此，揭示蛋白质翻译后修饰发生规律及关键蛋白质表达量的变化对理解蛋白质复杂多样的生物功能、疾病的发生发展具有很重要的意义。棕榈酰化修饰常发生在蛋白质半胱氨酸残基上，是一种动态、可逆的翻译后修饰形式，在细胞信号传导、凋亡和疾病发生中都具有非常重要的作用。本项目在总结棕榈酰化修饰现有分析方法的基础上，建立了2种棕榈酰化修饰蛋白质组分析新方法：.1）以棕榈酰化修饰标准肽段考察了商品化材料TS-6B的富集效果，并以此为富集载体结合label free定量蛋白质组学方法分析了SW480细胞中棕榈酰化修饰蛋白质组，共鉴定到92个蛋白质151个修饰位点；首次制备了抗棕榈酰化修饰泛抗体，并在此基础上对VCP的棕榈酰化修饰状态进行了实验验证。.2）制备了一种二硫二吡啶官能团化的新型磁性纳米功能材料，以此为富集载体建立了棕榈酰化修饰蛋白质分离富集新方法，结果表明，该法富集选择性非常好（即使在标准修饰肽段和BSA酶解肽段混合物按摩尔比1：500混合仍具有很好的富集选择性），明显优于现有商品化材料；即使对于初始绝对量仅为0.1 ng棕榈酰化修饰标准肽段的体系，经富集后仍具有很好的质谱响应信号；对标准修饰肽段的富集容量约为25μg/g(肽段/材料)。我们进一步用所建立的方法分析了鼠脑中的棕榈酰化修饰蛋白质组，共鉴定到1364个目标蛋白质（为现有文献中最大的数据集）。除已知的棕榈酰化修饰蛋白质（如SNAP25, PSD-95等），我们还发现了一些新的受棕榈酰化修饰调控的蛋白质和信号通路，并根据质谱数据选择了6个可信度不同的蛋白质进行了实验验证。.以功能化磁性微球为富集载体建立了金属结合蛋白富集新方法，从大鼠肝脏中共鉴定到185个可能的金属结合蛋白质。.此外，利用iTRAQ技术定量比较了结肠成纤维细胞和结肠癌细胞系的分泌蛋白质组，发现COL6A3在基质细胞中的表达水平高于上皮细胞，且与肿瘤分期、复发等呈正相关，并影响预后。