候选基因法筛选尼罗罗非鱼抗寒SNPs标记及其在育种中的应用

罗非鱼为世界性的重要养殖鱼类，但耐寒能力差，在我国大部分地区不能自然越冬，每年需要花费大量的资金和人力来解决越冬问题。而且近年来我国异常极端灾害性天气频发，罗非鱼养殖面临新考验。开发快速可靠的育种技术，加快培育罗非鱼抗寒新品种（系）十分迫切。本项目选择5个功能基因（脂肪酸脱饱和酶、脑室管膜素、热激蛋白HSP70、钙转运ATP酶和乙酰胆碱酯酶基因）作为尼罗罗非鱼抗寒性状的候选基因，通过分析基因SNPs和单倍型标记与抗寒性状的关联，筛选与罗非鱼抗寒性状密切相关的标记；根据标记选择亲本，分析子代基因型-表型-基因表达之间的关系，进一步验证SNPs的功能；将这些标记应用于罗非鱼选育中，评估标记辅助选择的效果。通过建立筛选和验证尼罗罗非鱼抗寒性状相关的SNPs和单倍型标记的方法，开展罗非鱼抗寒性状的分子标记辅助育种研究，将大大提高育种效率，缩短育种周期，也为其它鱼类分子标记辅助育种提供参考和借鉴。

罗非鱼为世界性的重要养殖鱼类，但耐寒能力差的特点限制其养殖产业的发展。本项目对尼罗罗非鱼抗寒性状相关的分子标记及相关基因在低温胁迫下的表达变化特征等进行了较为深入的研究。通过低温模拟试验和大田自然越冬试验结果表明，连续多代抗寒选育获得的尼罗罗非鱼耐寒品系具有较好的抗寒能力。采用直接测序法和一般线性模型方法分析筛选得到尼罗罗非鱼抗寒性状显著相关的SNP位点2个和SNP双倍型3个，并采用荧光定量PCR分析了不同水温条件下含有SNP标记的热激蛋白70基因（HSP70）和水通道蛋白基因（AQP1）的表达特征，结果表明SNP标记基因型与特异基因表达水平和罗非鱼抗寒性状之间存在相关性。采用RNA-seq技术解析了罗非鱼在30℃和10℃水温下的差异基因表达情况。在肝脏组织中筛选到差异表达基因5875个，其中上调表达基因3558个，下调表达基因2317个。在肌肉组织中筛选到差异表达基因3698个，其中上调表达基因2545个，下调表达基因1153个，并对这些差异基因进行了生物信息学分析。通过对表达谱序列进行分析，获得了一批SSR和SNP标记。这些结果为深入研究功能基因之间调控罗非鱼低温胁迫应激反应机制和建立与应用罗非鱼抗寒分子标记辅助育种技术提供更多重要的信息和依据。采用微卫星标记技术筛选得到2个罗非鱼抗寒性状密切相关的微卫星标记。通过对尼罗罗非鱼基因组甲基化水平的研究发现，长期低温适应下其基因组发生了去甲基化反应，总的甲基化水平降低。该研究有助于揭示罗非鱼耐寒的分子机制，为发展鱼类分子标记辅助育种技术和培育性状优良的鱼类品种（系）提供理论依据和技术基础。