氯化两面针碱基于miR-125b-2-3p/IER3调控轴抗HCC作用的机制研究

Currently, there lacks effective treatment for hepatocellular carcinoma (HCC). The emphasis of research was focused on developing new targeted therapy for HCC. Although, the anti-tumor effect of traditional Chinese medicine in HCC was previously reported, the mechanism underlying it is unclear. We have found the antagonistic effect of nitidine chloride (NC) on HCC based on our early-stage research. Then, we performed miRNA and mRNA sequencing on HCC xenografts in nude mice induced by NC for the first time and we discovered for the first time that miR-125b-2-3p and immediate early response gene 3 (IER3) were aberrantly expressed in HCC xenografts compared with the control group, which was closely associated with the formation of HCC. Meanwhile, IER3 was predicted by bioinformatics software to be otential target gene of miR-125b-2-3p. Therefore, a hypothesis was proposed that NC play an anti-tumor role through the miR-125b-2-3p/IER3 regulation axis in HCC. To verify the hypothesis, a combined method of RT-qPCR, cell transfection, CRISPR/Cas9, WB, invasion and metastasis assay and animal models was used to determine the differential expression of miR-125b-2-3p and IER3 caused by the NC interference on HCC from molecular, cellular and animal levels; to identify the role of miR-125b-2-3p and IER3 in HCC and the relationship between them and eventually to prove our hypothesis. We expected to provide new insights on the anti-HCC effect of NC in the new perspective of miRNA.

肝细胞癌（HCC）缺乏有效治疗手段，新药开发是研究重点。中药抗HCC早有报道，但机制未明。课题组前期对氯化两面针碱（NC）治疗HCC进行系列研究，发现NC有抗HCC作用，随后首次对NC作用的裸鼠HCC移植瘤组织进行miRNA、mRNA测序及分析，发现与对照组比，miR-125b-2-3p和人早期应答基因3（IER3）存在差异表达，并且均与HCC的发生密切相关，同时两者具有潜在靶向关系。因此，提出NC基于miR-125b-2-3p/IER3调控轴发挥抗HCC作用的假说，为验证假说，我们拟采用RT-qPCR、细胞转染、CRISPR/Cas9、WB、侵袭转移及动物模型等手段，从分子、细胞及动物水平验证NC作用于HCC致miR-125b-2-3p和IER3的表达改变；明确miR-125b-2-3p和IER3在HCC中的作用及靶向关系；最终证明假说。从而以miRNA新角度阐明NC抗HCC的分子机制。

中药氯化两面针碱（NC）抗肝细胞癌（HCC）早有报道，但具体的作用机制尚未明确。本研究通过体外细胞实验和体内裸鼠移植性HCC模型，对NC治疗HCC进行系列研究，发现NC具有明显的抗HCC作用，随后首次对NC作用的裸鼠HCC移植瘤组织进行miRNA、mRNA高通量测序及分析，发现与空白对照组相比，miR-125b-2-3p和人早期应答基因3（IER3）存在差异表达，并且均与HCC的发生发展密切相关，同时两者具有潜在靶向关系。因此，本项目提出NC基于miR-125b-2-3p/IER3调控轴发挥抗HCC作用的假说，并进行了后续的系列研究。. 为了验证上述假说，我们采用免疫组织化学、RT-qPCR、细胞转染、细胞增值、流式细胞、细胞侵袭和转移等实验手段，在体外培养的HCC细胞层面再次证实了NC抗HCC的作用，结果显示NC作用于HCC细胞能够明显抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制HCC细胞的侵袭迁移。利用HCC细胞和人体组织检测了miR-125b-2-3p和IER3在HCC中的表达改变，结合临床病理参数分析它们的临床意义及潜在作用机制，结果均显示miR-125b-2-3p在HCC中表达降低，而IER3表达升高，并且与HCC的分化、临床分期等多个临床病理参数密切相关。进一步在体外实验中，研究了miR-125b-2-3p在HCC细胞中的生物学功能，结果提示miR-125b-2-3p能够抑制细胞增值、促进细胞凋亡、并且抑制细胞侵袭和迁移，综合分析发现NC作用于HCC细胞可以增加miR-125b-2-3p的表达，并且影响HCC的生物学功能，由此推测NC抗HCC作用与miR-125b-2-3p密切相关。. 在项目研究过程中，我们发现了其他一些具有潜在研究价值的非编码RNA、mRNA，因此对它们展开了系列研究，探索它们在HCC中的作用及潜在机制。例如：通过高通量测序检测NC作用于HCC前后的circRNA差异表达谱；探究lncRNA MIR22HG在HCC中的表达、作用及机制，并检测NC作用于HCC前后MIR22HG的表达变化等。. 该研究完成了既定的考核指标。发表论文7篇，其中SCI收录论文5篇；培养博士研究生1人、硕士研究生2人。