粘虫醛酮还原酶代谢胆甾烷酮的分子机制及在植物抗虫性中的应用研究

Cholesterol is cellular membrane component in most insects.It modulates and regulates permeability, thermomechanics, lateral diffusion, and protein function.Insects lack the key enzyme, squalene synthase, in the sterol biosynthetic pathway which exists in yeasts, plants and vertebrates. Insect herbivores therefore acquire this essential nutrient from plants. Cholestanone is one of the cholesterol derivatives and it differs from cholesterol only by lacking a C5 double bond and replacing a hydroxyl with a ketone at C3 position. Insects studied so far can cannot substitute cholestanone for cholesterol but can convert cholestanone to cholestanol to reduce the negative effects. Large quantity of dietary cholestanone can affect insect performance negatively or even lead to the death of insects. A transgenic tobacco line with elevated 3-ketone steroids was reported to be successfully controlling the population of several lepidopteran species under laboratory conditions. In　previous studies, we screened out candidate genes potentially involved in cholestanone metabolism in a lepidopteran insect. Based on these results, using Mythimna separata（Walker）as the model organism, we design experiments to further define the target gene in converting cholestanone into cholestanol and clarify the mechanism of this process. The effects of reducing the expression of the target gene and its potential in improving the transgenic tobacco line in controlling chewing insects will be examined. The results will help illustrate how insects handle different sterols in food. At the same time, the gene involved in this process can be used in developing new insect-resisting plants.

胆固醇是昆虫重要的外源营养物质。胆甾烷酮是胆固醇类似物，但不能替代胆固醇。胆甾烷酮及其衍生物能够显著抑制昆虫种群增长，可用于提高植物的抗虫性。粘虫等鳞翅目昆虫可将胆甾烷酮及其衍生物转化为胆甾烷醇而降低其负面作用，但代谢机制仍不清楚。申请人前期实验结果显示醛酮还原酶基因可能是该代谢的关键因子。本项目拟以粘虫为研究对象，通过现代分子生物学技术，阐明该基因在不同组织中的表达模式和其表达的酶蛋白特性；然后，利用RNAi技术和CRISPR/Cas技术干扰其表达，并通过气质联用仪测定胆甾烷酮代谢变化，从而揭示该基因在胆甾烷酮代谢中的作用。同时利用VIGS技术测试该基因表达沉默后，胆甾烷酮对粘虫取食寄主植物的影响。本项目以期阐明胆甾烷酮代谢的关键因子，为完善昆虫固醇代谢知识体系提供基础资料，对建立和发展以干扰固醇代谢为手段的害虫防控技术具有重要的理论价值和应用价值。

胆固醇是昆虫重要的外源营养物质。胆甾烷酮是胆固醇类似物，但不能替代胆固醇。通过改变植物的固醇组成可提高其抗虫性。由于脊椎动物自身能够合成胆固醇，所以这类植物一般对人畜等环境动物影响较小。显著提高植物中胆甾烷酮及其衍生物的含量对昆虫的种群增长有明显的抑制效果。鳞翅目昆虫可将胆甾烷酮及其衍生物转化为胆甾烷醇而降低其负面作用，但其代谢机制仍不清楚。本项目以粘虫为研究对象，通过使用人工饲料饲喂，发现粘虫能够代谢胆甾烷酮以降低其毒性。通过转录组分析、荧光实时定量技术、系统发育树分析等技术分析筛选得到在肠道高表达的Mse29229基因可能参与了胆甾烷酮的代谢，该基因的表达可被胆甾烷酮的诱导而升高。根据结构和同源性分析，Mse29229蛋白被命名为AKR2E9。通过蛋白体外表达和酶活分析发现，AKR2E9重组蛋白具有将胆甾烷酮转化为胆甾烷醇的活性。使用CRISPR/Cas9技术敲除该基因并结合GC-MS分析发现，粘虫AKR2E9基因功能缺失会导致其在胆甾烷酮上的发育迟缓且代谢胆甾烷酮的能力降低。此外，通过胆固醇氧化酶实验发现，当胆固醇的羟基与油酸的羧基形成酯键而被保护起来不被氧化时，AKR2E9基因的缺失不会影响幼虫的存活。通过Western-blot实验进一步阐明，AKR2E9蛋白受胆甾烷酮的诱导而表达升高且AKR2E9蛋白代谢胆甾烷酮的反应发生在肠道细胞内。综上所述，本项目以粘虫为研究对象，首次找到了昆虫体内代谢胆甾烷酮的关键因子-醛酮还原酶基因AKR2E9，并通过分子生物学实验和生理生化实验阐明了该基因在代谢胆甾烷酮以降低其毒性的重要功能。这些信息完善了昆虫固醇代谢的理论体系，对建立和发展以干扰固醇代谢为手段的害虫防控技术具有重要的理论价值和应用价值。