基于深度突变扫描的醛酮还原酶催化与手性识别机制解析及催化性能强化

(R)-Chiral alcohols are important building blocks for chiral pharmaceuticals, agrochemicals and materials, and their efficient synthesis has been the focus of academia and industry. Biocatalytic anti-Prelog stereoselective reduction of prochiral ketones by stereospecific alde-keto reductases (AKRs) is a promising method for optical pure (R)-alcohol synthesis. Previously, our group has constructed a number of robust, R-stereospecific AKR mutants via directed evolution. Further, we will develop the deep mutational scanning of ‘sequence-structure-function’ maps for AKRs, which is based on the high-throughput DNA sequencing and functional selection. Rationally combination of beneficial substitutions will be guided by the static and dynamic information extracted from the deep mutational scanning, yielding AKRs with excellent catalytic performance for the target (R)-alcohols. This project lays the foundation for the de novo design of industrial AKRs through catalytic mechanism elucidation employing deep mutational scanning methodology.

(R)-手性醇是手性医药、农用化学品和材料的重要合成砌块，其手性生物催化合成技术是产学界关注的焦点。利用反-Prelog规则醛酮还原酶不对称还原前手性酮合成(R)-手性醇具有重要的学术意义和工业应用价值。项目组前期已挖掘到多种微生物来源的醛酮还原酶基因，利用定向进化技术构建了醛酮还原酶突变体。在此工作基础上，项目将建立基于先进的二代测序技术和自行构建的高通量筛选方法组合的醛酮还原酶深度突变扫描技术，通过构建醛酮还原酶的全局饱和突变库，系统研究突变体功能，绘制醛酮还原酶的动态“序列-结构-功能”全局构效图谱；进一步依据全局图谱的静态和动态数据信息，提取醛酮还原酶对各种酮化合物不对称还原的有义突变位点、实施理性重组，高效创制催化性能优越的醛酮还原酶“超级”突变体。本项目的实施将有助于明晰醛酮还原酶的催化和手性识别机制，为醛酮还原酶理性设计提供新技术。

项目组运用深度突变扫描技术，获得醛酮还原酶KmAKR、KlAKR“序列-结构-功能”动态全局谱图；利用构效关系指导醛酮还原酶KmAKR、KlAKR理性设计。项目的主要研究计划包括：醛酮还原酶KmAKR、KlAKR全局饱和突变库的构建与高通量筛选，醛酮还原酶KmAKR、KlAKR催化和手性识别的分子机制解析，醛酮还原酶KmAKR、KlAKR有义突变位点筛选，醛酮还原酶KmAKR、KlAKR全局构效关系分析。.围绕项目既定的研究目标和研究内容，项目组在国内外生物工程领域学术期刊上共发表SCI论文12篇，授权发明专利5 项；获中国石油和化学工业科技进步一等奖1项（项目负责人排名第1），中国专利优秀奖1项（项目负责人排名第2）；项目主要完成人邱帅博士生获浙江省优秀学位论文提名奖（2022年）。项目执行期间已培养邱帅博士，喻寒、程英男、陈祎、王丹娜、班善赟、翟秋瑶、谢剑勇、胡心怡、金灵俊、高小凡、孟康明、周盛怡、刘倩等研究生。