利用SPR技术寻找HIV-1病毒Vpu蛋白抑制剂

Vpu protein is one of special HIV-1 virus accessory proteins and related to HIV-1 release. It's becoming a hotspot for anti-HIV research. In this project, an interaction screening model targeted the HIV-1 Vpu protein will be developed by "label-free" SPR technology, and the inhibitors targeted the various structural and functional domain will be found. Vpu protein and its functional segments which are expressed and purified from E.coli cell will be immobilized on the sensor chip surface by amino coupling or His-tag capture. The affinity of the interaction between the small molecule compounds and Vpu protein will be evaluated. The binding sites for small molecule compounds will be confirmed by analysis the difference between the interaction with Vpu protein transmembrane domain and cytoplasmic segment. Three candidates which are competing with Tetherin protein, binding with Vpu transmembrane domain and binding with cytoplasmic segment will be selected to research anti-HIV activity on the cell level. According to the interaction between compounds and Vpu protein and the results of anti-HIV activity, the structure-activity relationship and mechanism will be announced. The relationship of the different domain of Vpu protein and anti-HIV activity will be explored. Some effective and low toxicity anti-HIV lead compounds of anti-HIV drugs will be found and developed.

Vpu蛋白是HIV-1病毒特有的与病毒释放相关的辅助蛋白,正成为抗HIV药物研究的热点。本项目以Vpu蛋白为靶点，利用"非标记"的SPR技术构建Vpu互作分子筛选模型，针对Vpu蛋白不同结构域进行抑制剂的发现并研究其作用机制。项目利用原核细胞表达Vpu蛋白及片段，利用氨基偶联、His-tag捕获等方式将蛋白固定在芯片表面，通过小分子化合物与Vpu蛋白的相互作用进行整体水平的亲和力评价；利用化合物与Vpu跨膜区和胞质区相互作用的差异进行结合位点的分析；选取与Tetherin蛋白竞争结合的候选物、Vpu跨膜区候选物及Vpu胞质区候选物进行细胞水平抗HIV-1研究。结合小分子化合物与Vpu蛋白相互作用情况及抗HIV活性结果进行构效关系分析和作用机制研究，探索Vpu蛋白不同功能区与抗HIV-1作用的相关性，并最终从候选物中发现高效低毒的抗HIV先导物，为开发具有自主知识产权的抗HIV新药奠定基础。

Vpu蛋白是HIV-1病毒特有的与病毒释放相关的辅助蛋白,正成为抗HIV药物研究的热点。今年来研究发现Vpu蛋白可拮抗人内在抗病毒因子，这位Vpu靶点的药物研究提供了新的设计思路。然而，目前Vpu蛋白的靶向药物筛选方法有限，靶点药物开发仅处于初期阶段。克隆、表达、纯化HIV-1Vpu蛋白，是其筛选研究的基础。本研究首先采用E.coli细胞表达带有His-Tag的Vpu蛋白，并纯化获得较高活性的Vpu蛋白。Vpu蛋白通过氨基偶联法偶联至CM5芯片，通过阳性化合物（IMB-LA）与Vpu蛋白的结合，验证了偶联蛋白的生物活性。对30株微生物发酵液样品进行筛选，最终得到了一株与Vpu具有高亲和的发酵液，编号为s-28，并对筛选结果进行进一步确证。此外，为了验证IMB-LA与Vpu蛋白的结合机理，又对Vpu蛋白胞外区肽段进行了研究。胞外区肽段为：（P-13379）LRQRKIDRLIDRLIERAEDSGNESEGEISALVEMGVEMGHHAPWDIDDL，采用固相合成法合成，纯度大于90%。利用氨基偶联法将肽段偶联于CM5芯片，建立胞外区筛选模型。通过测定IMB-LA与胞外区的相互作用，根据结果判断IMB-LA与Vpu的结合区域为胞外区。利用胞外区模型，对Vpu整蛋白筛选获得的s-28发酵液进行确证，研究结果表明，s-28发酵液不与Vpu胞外区进行结合。为确证跨膜区与IMB-LA和s-28的结合情况，需建立跨膜区筛选模型。经过多次尝试，仍不能获得整条多肽，跨膜区多肽模型建立未成功。利用构建成功的筛选模型对发酵液和化合物进行筛选，部分化合物进行抗HIV-1活性评价，并归纳小分子化合物与Vpu蛋白互作的机制，推测小分子化合物与Vpu蛋白互作机制。.综上所述，本研究建立的基于SPR技术的Vpu蛋白靶向药物筛选方法可用于Vpu抑制剂的筛选，为Vpu蛋白的靶向药物研究提供了可靠的实验数据和新的研究思路。