腐败希瓦氏菌适冷酶的低温应激表达与冷链流通中凡纳滨对虾腐败相关性研究

Cold chain logistics is broadly applied to maintain the quality of aquatic products, although some kinds of microorganisms can still survive and grow in the low-temperature environment by producing a large amount of cold-adapted enzymes, which lead to the deterioration of aquatic products. However, little information about the effect of these cold-adapted enzymes from spoilage bacteria induced by low temperature on the spoilage of aquatic products has been reported yet. In this project, Shewanella putrefaciens isolated from Pacific white shrimp will be studied as a model. The growth curves, the activity of protease and the production of metabolites in vitro are going to be determined to evaluate the spoilage capacity of S. putrefaciens under low-temperature environments. The differential expression levels of extracellular enzymes will also be compared by proteome technology. The potential cold-adapted proteases of S. putrefaciens causing spoilage will be selected and their expression levels during the cold chain distribution process will be determined via Q-RT-PCR after the strain is inoculated into the shrimp, and their relationship with the changes of quality indicators of shrimp will be discussed. This study will improve the understanding about the spoilage process of aquatic foods under low temperature environments, and provide a proposal to improve the effectiveness of cold chain logistics on the quality control of aquatic products.

冷链流通是保持生鲜水产品品质的重要手段，但仍有部分腐败微生物能适应低温环境并分泌适冷蛋白酶。腐败微生物酶解作用是导致水产品腐败变质的主要原因。目前，有关腐败微生物适冷酶的低温应激表达与水产品腐败相关性研究还未见报道。本项目以凡纳滨对虾典型腐败微生物腐败希瓦氏菌为研究对象，通过测定腐败希瓦氏菌在低温环境下的生长状况、酶活性及腐败产物含量来分析其冷适应特性和低温下的致腐败能力；应用蛋白质组学技术对比低温刺激下腐败希瓦氏菌差异蛋白的表达情况，并筛选出腐败希瓦氏菌产生的可能导致凡纳滨对虾腐败的主要适冷酶类；将腐败希瓦氏菌接种至无菌虾体上，运用反转录定量PCR法测定冷链流通中腐败希瓦氏菌分泌并与对虾腐败相关的适冷酶表达水平，分析其与对虾品质指标的相关性以确定导致对虾腐败的关键适冷酶。该项目的开展将有助于加深对低温环境下水产品腐败形成原因的了解，并为加强冷链流通在水产品品质控制方面的作用提供理论依据。

本项目受资助后按照预定计划开展相关实验，并根据开展过程中得到的实验结果对实验内容进行适当调整、补充和完善，取得了一系列研究成果：运用高通量测序结合传统分离鉴定方法研究凡纳滨对虾在不同温度下的菌群变化规律，并从冷藏腐败对虾中筛选到特定腐败菌腐败希瓦氏菌野生菌株QY38，作为后续实验的研究对象；研究了温度对腐败希瓦氏菌酶活性和代谢活性的影响；对腐败希瓦氏菌模式菌株DSM6067在不同温度下的差异蛋白质组表达进行分析后，进一步对野生菌株QY38在适应低温过程中（30℃到4℃）的蛋白质表达变化过程进行解析，并运用反转录定量PCR法对几种酶表达水平进行验证，发现低温并不能抑制腐败希瓦氏菌的致腐败能力，且其在低温环境下的代谢行为与最适温度下有较大不同，相同单位数量腐败希瓦氏菌的低温下会产生更多具有催化活性的酶，如蛋白酶（protease）、肽酶（peptidase）、马来酰乙酰乙酸异构酶（maleylacetoacetate isomerase）、甲硫氨酸γ-裂解酶（methionine gamma-lyase）和鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase）等，参与虾肉蛋白的水解及氨基酸的降解。这可能是腐败希瓦氏菌这类适冷微生物为适应低温环境而采取的策略，但该反应可能会导致凡纳滨对虾等水产品在冷藏过程中营养物质和滋味口感的损失。本项目进一步研究了由断链导致温度波动情况下腐败希瓦氏菌的生长及其相关情况，发现温度波动可降低腐败希瓦氏菌对低温的敏感性，使腐败希瓦氏菌的生长速率和氨基酸代谢活性显著提高，解析了断链加剧水产品品质劣变的原因。.本项目的研究结果为进一步揭示腐败希瓦氏菌在低温下如何改变代谢行为并影响凡纳滨对虾品质提供了新的依据。本项目完成了合同规定的计划任务和技术指标要求，发表标注本项目资助的SCI论文4篇，EI论文5篇。