C型凝集素样受体OCILrP2在巨噬细胞中调控IL-6的作用及分子机制研究

C-type lectin-like receptors (CTLRs) play an important role in immune defenses of host recognizing and defending. OCILrP2 is involved in T cell activation and DC cell maturation, but its function and mechanism in macrophages have not been reported. Our previous study found that OCILrP2 was up-regulated in macrophages stimulated by LPS, and silencing OCILrP2 by RNAi significantly enhanced the expression and duration of the inflammatory cytokine IL-6, as well as decreased phagocytosis and migration capacity of macrophages. These results suggested that OCILrP2 plays an important role in the regulation and function of macrophage inflammatory response. Now, this project is aimed at elucidating the molecular mechanism underlining the IL-6 signaling and the innate immune responses mediated by C-type lectin receptor OCILrP2. By using the technologies of molecular cloning technology, reporter gene system, siRNA, flow cytometry, immunoprecipitation, ELISA and immunofluorescence analysis, we will identify the molecular target of OCILrP2 and investigate the function of OCILrP2 in innate immunity; Systematically explore the mechanism of OCILrP2 in the inflammatory response of macrophages through the analysis of genomic, transcriptome or proteomics. This project will help us to enrich the understanding of the regulation network of innate immunity and shed new light on the treatment of infectious diseases.

C型凝集素样受体（CTLRs）在机体免疫稳态平衡中起着重要作用。其成员OCILrP2在T细胞活化和DC细胞成熟过程中发挥重要作用，而在巨噬细胞中的功能尚未报道。我们前期研究发现OCILrP2在LPS刺激下的巨噬细胞中上调表达，沉默OCILrP2显著增强IL-6的表达水平，并降低细胞的吞噬和迁移能力，提示OCILrP2对巨噬细胞功能和炎症反应具有重要影响。本项目拟通过构建OCILrP2表达、敲除载体和报告基因系统，探讨其对细胞因子IL-6的负向调控作用；采用ELISA、流式细胞分析等技术，研究其在巨噬细胞LPS应答中的功能；通过质谱分析、Co-IP和免疫荧光等技术寻找OCILrP2的分子靶点及其具体分子机制；结合组学分析，系统阐明OCILrP2在巨噬细胞免疫应答中的作用机制。本项目旨在阐明OCILrP2在巨噬细胞中调控IL-6的作用及其分子机制，为感染性疾病的临床诊治和药物研发提供理论基础。

天然免疫是宿主对抗病原体入侵的第一道防线，炎性细胞因子的精确调控对于维持免疫平衡至关重要。前期研究表明破骨细胞抑制凝集素相关蛋白-2（Ocilrp2/Clec2i）广泛表达于树突状细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞和活化的T细胞中。Ocilrp2是激活T细胞和NK细胞的一个重要调节分子。然而，Ocilrp2在巨噬细胞中的功能和炎症反应中的作用机制仍不清楚。本研究就拟以Ocilrp2为靶点，深入研究其在天然免疫巨噬细胞中调控炎性细胞因子的作用和分子机制。首先，我们发现Ocilrp2的不同转录本在巨噬细胞中的表达有差异，Ocilrp2-v2主要表达于巨噬细胞中。在天然免疫的不同配体刺激下的腹腔巨噬细胞中Ocilrp2的 mRNA和蛋白水平下调，这与永生化巨噬细胞RAW264.7表达模式不同。进一步分析发现在腹腔巨噬细胞中Ocilrp2表达受NF-κB和ERK信号通路的调控。随后，我们通过siRNA抑制巨噬细胞中的Ocilrp2的表达，LPS和VSV刺激显著上调了炎性细胞因子IL-6的表达，而过表达Ocilrp2的iBMDM细胞中，IL-6表达减少。我们通过细胞信号通路筛查发现沉默Ocilrp2上调了syk信号通路的活化水平，从而导致NF-κB信号活化，诱导IL-6的合成。进一步，我们发现DAP12作为syk信号通路关键的接头分子参与了Ocilrp2信号通路的活化，沉默Ocilrp2促进Dap12与Syk的结合，上调Syk的活化水平。总之，我们确定一个新的膜表面分子Ocilrp2在巨噬细胞中的TLR4信号通路和炎性细胞因子负调控的关键作用，并对TLR和Syk信号通路之间的串联增加了认识，为炎性疾病的诊疗和小分子药物研发提供了理论基础。