草莓果实中FvABAR-FvRRP1-FvRIPK1蛋白复合体作用的分子机制

Abscisic acid (ABA) plays an important role in the regulation of the fruit ripening, but its action molecular mechanism is yet not well understood. A fruit-ripening-related FaABAR-FaRRP1-FaRIPK1 protein complex has been preliminarily identified through the FaABAR-baited, yeast-two-hybrid technique from octoploid strawberry fruit. Given the genetic background complexity of octoploid strawberry, therefore, diploid strawberry is used in the present study. First, the coding sequences of FvABAR, FvRRP1 and FvRIPK1 were cloned, expressed and purifed using yeast cells, then the purifed proteins are used to prepare antibodies; second, further verification of FvABAR, FvRRP1 and FvRIPK1 interaction and the affect of ABA on the interaction is analyzed using ITC, SPR and pull down techniques; third, single, double and triple mutants of the three genes are estabolished using CRISPR/Cas9 technique; finally, the action molecular mechanism of FvABAR-FvRRP1-FvRIPK1 complex is estabolished through recovery tests of the mutants. In all, a new ABA signaling way in the regulation strawberry fruit development is provided, and laying the molecular foundation for the fruit-ripening-regulated mechanism。

脱落酸（ABA）是调控果实成熟的重要激素，然而其作用的分子机制目前还不十分清楚。以FaABAR为诱饵，从八倍体草莓果实中初步鉴定了一个与成熟相关的FaABAR-FaRRP1-FaRIPK1蛋白复合体。考虑到八倍体草莓遗传背景的复杂性，本研究拟采用二倍体草莓为材料，从果实中分离FvABAR、FvRRP1和FvRIPK1基因的编码区，并利用酵母细胞分别对其进行蛋白表达、纯化及制备抗体；分别通过热等温滴定、表面等离子体共振和免疫共沉淀技术进一步验证FvABAR、FvRRP1和FvRIPK1蛋白互作及ABA对互作的影响；通过CRISPR/Cas9技术建立FvABAR、FvRRP1和FvRIPK1基因敲除的单、双和三突变体，通过恢复试验剖析FvABAR-FvRRP1-FvRIPK1复合体作用的分子机制。最终揭示一条新的ABA调控草莓果实发育的信号转导通路，为果实成熟调控的分子基础研究提供支撑。

项目针对脱落酸（ABA）调控非呼吸跃变型果实成熟的分子机制还不清楚的科学问题，以草莓为研究材料揭示ABA调控果实成熟的网络调控机制。在建立草莓二倍体草莓转基因体系的基础上，证实FvRIPK1在FvABAR的上游。发现草莓囊泡运输相关蛋白RRP1和类受体蛋白激酶RIPK1是ABA新的信号组分。证实草莓RRP1参与果实成熟是通过整合了ABA转运和信号转导途径实现的，即RRP1通过囊泡运输能从胞外运输ABA到胞内，并将ABA从RRP1上传递到PYR上，进而激活了ABA信号转导级联系统和果实成熟。发现草莓RIPK1参与果实成熟是通过ABAR共受体途径实验的，进而提出ABA调控草莓果实成熟保守和新的生物学机制。随着草莓果实成熟启动，ABA水平不断增加，ABA结合其受体FaPYR1后，通过植物中保守的“ABA-PYR1-ABIl-SnRK2”信号途径启动了果实的成熟，随后FaABAR通过‘ABA-ABAR-RIPK1-ABI4’新的信号途径协同FaPYR1发挥作用，加速草莓果实的成熟。同时揭示了ABA调控果实成熟复杂的分子网络机制涉及了糖、多胺、乙烯、IAA、ROS和钙离子。最后确立了ABA调控果实品质形成的机制，并建立ABA调控草莓果实品质形成的应用技术。通过草莓分根和双行凹形垄栽培试验发现，适度控水明显提高植物ABA、生长素和叶绿素的含量，证实“草莓双行凹形垄”栽培模式具有潜在的推广前景。. 研究结果在“Plant Physiology”等国际期刊上发表基金标志SCI论文11篇。获得发明专利2个，实用新型1个。以“脱落酸调控非呼吸跃变型果实成熟的生理及分子机制”获得北京市自然科学二等奖1项。培养青年教师1名、博士后2名、博士1名、硕士12名。项目在科学理论、应用技术和人才培养等方面取得了显著成果，超额完成预期研究目标，为果实成熟和品质调控奠定理论和技术支持。