核磁中等交换极限下蛋白-先导化合物低丰度结合态结构表征新方法

The protein-ligand interaction modes are at the heart of rational drug discovery. The availability of complex crystal structures is often limited by the dynamic nature of the targets and/or the low aqueous solubility of the lead compounds. These leads normally fall into the NMR intermediate exchange scale, which can cause severe line broadening beyond detection of interface resonances. Using a highly skewed protein/ligand ratio, we have combined the ligand fluorine Pseudocontact shifts (PCSs) with chemical exchange saturation transfer to solve this bottleneck problem. As exemplified in the anti-cancer-metastasis target RhoGDI2, we have identified several lead-like inhibitors at intermediate affinities. We plan to develop new approaches to determine the ligand-observed proton PCSs using relaxation dispersion, and proton paramagnetic relaxation enhancement, even in the limit of NMR intermediate exchange. These intermolecular structural restraints of the low-populated bound states of the ligands will be used to generate the complex structural models, which will guide further design and synthesis of more potent and more selective inhibitors. We will try to solve the complex crystal structures of the highly soluble analogs to cross validate our NMR model. The anti-invasion and metastasis activities of these inhibitors will be assayed as well. Our study shall enlarge the application of NMR spectroscopy in the field of structure-based drug discovery. Meanwhile, it will provide essential chemical probes for the functional studies of RhoGDI2, and prototypical candidates to suppress tumor cell metastasis.

蛋白-配基的相互作用模式是理性药物发现的核心。复合物晶体常受限于靶点蛋白动态特性和先导化合物的水溶性，这类化合物又恰处于核磁中等交换尺度，导致结合界面的核磁共振信号谱线严重增宽甚至无法检测。在极低的蛋白/配基比例下，我们开发的配基氟赝接触位移和化学交换饱和传递联用新技术可解决这一难题。以抗肿瘤迁移靶点RhoGDI2为例，在我们已鉴定的多个中等亲和力的抑制剂基础上，拟进一步开发核磁中等交换极限下，配基氢的赝接触位移和弛豫弥散联用的新技术，以及配基氢的顺磁弛豫增强技术,获取低丰度结合态的分子间结构约束, 搭建复合物结构模型。进而在结构指导下，设计合成更高活性和选择性的小分子抑制剂，尝试解析高水溶性类似物的复合物晶体结构，分析其抗肿瘤细胞迁移活性。这将拓展核磁共振波谱在基于结构的药物发现中的应用，并为后续RhoGDI2的功能研究提供重要的化学探针和潜在的抗肿瘤迁移药物前体。

靶点-抑制剂的相互作用模式对于理性药物发现至关重要。我们开发了蛋白-先导化合物低丰度结合态结构的核磁表征方法，通过向小分子溶液中添加低比例的顺磁标记蛋白质，获取配基结合态的氢原子赝接触位移和顺磁弛豫增强等结构约束。我们进而将这些方法拓展应用到基于结构的药物先导化合物发现领域。例如，PHF20L1的第一个Tudor结构域识别组蛋白和非组蛋白的甲基化，但Tudor1的自由态结构显示的是闭合构象，如何识别配基的机理未明。我们因此开展了核磁弛豫弥散和分子动力学模拟研究，表明PHF20L1的Tudor1结构域有一个预先存在的低丰度构象，其芳香笼残基构象显著重排。复合物晶体结构表明Tudor1利用这个低丰度开放构象，来识别DNMT1的K142甲基化以及核磁片段筛选发现的抑制剂，并在肿瘤细胞验证了PHF20L1识别DNMT1的机理。这一构象选择机制有助于开发看起来不可药结构域的抑制剂。在新冠病毒疫情期间，鉴于低分子量老药有更高的概率来完全匹配与潜在抗新冠靶点的互作，我们提出了通过片段筛选方法来鉴定这些药物的策略，发现了新冠病毒主蛋白酶和macrodomain 3的抑制剂，通过核磁约束搭建了靶点和抑制剂的结合模型，并解析了部分抑制剂的复合物晶体结构，我们的研究表明片段筛选可用于鉴定SARS-CoV-2以及其它潜在靶点的低分子量老药。另外，我们针对了数个表观遗传调控靶点开展了先期研究，发现了NSD1的SET结构域、TDP-43的串联RRM结构域、AF9 YEATS结构域的抑制剂，并通过核磁共振方法表征了ORC2 wing helix结构域的动态特性。在本项目的支持下，我们共发表标注基金号的研究论文7篇，应邀综述2篇，申请专利2项，获王天眷波谱学奖和安徽省杰青项目，培养博士毕业生1名，硕士毕业生2名，多次参加APNMR等国内外学术会议交流，并组织了2019年生物相分离与相变国际研讨会等，原定目标已全部完成。