蛋白-蛋白热点结合区域的化学位移快速指认和片段设计新方法

基于片段的药物设计与发现中的关键问题是解析弱结合的蛋白-片段复合体结构。这类复合体实验上难以结晶，而传统的核磁化学位移滴定等手段未能提供精确的热点结合区域的拓扑，特别是小分子和蛋白的相对取向信息缺失。我们拟以和肿瘤细胞生长和迁移密切相关的LARG为模型蛋白，测量三组正交的残留偶极耦合数据，开发其PDZ结构域多肽结合区域的主链化学位移快速指认方法。结合晶体学结构和化学位移扰动实验，应用这一指认方法到DH结构域的小分子结合位点。DH结构域的小分子配基将通过数据库结构搜索，分解成两个具有药物官能团物化特性的片段分子。通过测量结合小分子配基后的残留偶极耦合数据，优化结合后的DH结构域构象。应用转移RDC测量两个片段相对于DH结构域的取向，开发取向优化的片段设计新策略。

蛋白-蛋白互作（PPI）的抑制剂研究被誉为药物发现的明珠。PPI的“热点结合区域”相对于蛋白激酶的口袋，更为狭长舒缓。这类口袋更适合从低分子量（片段）出发，在结构的基础上逐步优化。国际上基于片段的先导化合物发现已经如火如荼，我们因此独立自主的建立了国内首个高度自动化的核磁片段筛选设施。完成了调控肿瘤迁移的多个小GTP酶相关靶点的核磁片段筛选。在基于结构的片段优化与设计中，首先需要确证苗头化合物结合到热点区域。我们起始选择了LARG的PDZ结构域，测量了多组残留偶极耦合、赝接触位移和顺磁弛豫增强效应，以及诱导产生的相应小分子效应。PDZ的晶体结构揭示其在成晶条件下形成了Domain Swapping的二体。目前正在探索在单体-二体平衡状态下的核磁新技术的应用。.同时针对新兴的表观遗传调控靶点开展了一系列研究。例如，作为染色质重塑复合物BAF的两个互为补充的催化亚基，BRG1和BRM的异常和肿瘤等疾病密切关联。仅抑制BRM的选择性小分子将在机制研究和早期药物发现中发挥着巨大的作用。相比于BET亚家族能识别双乙酰化组蛋白的热点区域，BRM仅能识别单乙酰化组蛋白，口袋更为狭窄，并与BRG1非常类似，因此给选择性小分子的发现带来了巨大的挑战。我们运用核磁片段筛选，寻找到了BRM的苗头化合物，通过初步的类似物演化，获得了多个亲和力小于50微摩的抑制剂，解析了蛋白和小分子的复合物晶体结构，通过结合模式的分析，优化获得了1.3微摩的类先导化合物KQ72。KQ72对BRM的高度类似蛋白BRG1的选择性达到77倍，对其它溴结构域的选择性超过100倍，体外GST pull down表明KQ72剂量依赖性的抑制BRM溴结构域和组蛋白的结合。KQ72在肿瘤细胞里也有效抑制了BRM和染色质的互作。KQ72有效抑制了BRG1缺失型的非小细胞肺癌细胞的增殖，而对其它类型的肿瘤细胞增殖影响很小，这与最新发现的BRG1/BRM之间的合成致死关系相一致。KQ72导致了H1299细胞的p21 mRNA和蛋白水平上调，β-半乳糖苷酶水平上调，表明这个小分子通过老化来调控肿瘤细胞的增殖。从而阐明了BRM溴结构域-染色质互作的分子机制，验证了选择性的BRM溴结构域小分子类似于全长BRM knockdown，通过合成致死策略抑制肿瘤增殖。.共发表SCI论文1篇，国内核心刊物1篇，1篇已投稿。