Q7-31植物细胞壁降解酶系组成及协同作用的研究

There are many difficult problems for human being in 21 century, like energy crisis, lack of the resources, while a large amount of plant biomass source on earth is produced the photosynthesis every year. It plays very important roles for sustainable development of human being to make use of these plant biomass sources into bio-energy. In this study, the components of the enzyme from the strain of Fusarium sp. Q7-31 that could produce cell wall degrading enzyme (CWDE), their key enzymes and synergistic functions will be studied. Genes of CWDE were cloned and expressed in E.coli; the ratios of different enzyme from CWDE and the characteristics and reaction kinetic of these enzymes were studied. The expression and regulation of genes from CWDE and their structure and function would be deeply studied at the level of gene-protein. This studied will be helpful for the revealing the relationship of gene, protein and degradation of the cell wall function and also providing some models for other types of enzyme studies. It also could solve some problems of low effect and enrich the knowledges of enzyme ratios in the bio-energy research. The strain of Q7-31were isolated from Qinghai-Tibetan Platea, it also provide more information on gene and protein for the fungi resoures from Qinghai-Tibetan Platea.

能源危机、资源匮乏，是21世纪急需缓解的难题。光合作用赋予我们巨大的生物质资源，如何有效利用这些生物质将其转化为生物能源，对人类可持续发展具有非常重要的意义。本项目以能产生细胞壁降解酶的菌株Q7-31为材料，研究其植物细胞壁降解酶酶系组分、关键酶及最佳比例、协同作用、酶的结构等理论方面；通过酶谱鉴定测定酶氮末端氨基酸序列、克隆出5-15种关键酶并在大肠杆菌中进行克隆与表达；研究这些关键酶的酶学性质、酶促动力学等。从基因－蛋白质水平揭示植物细胞壁降解酶的结构与功能及其基因的表达调控规律。本研究有助于揭示基因、蛋白质和细胞壁降解之间的关系，并为其他类型的降解酶的研究提供借鉴。解决目前生物能源研究中的酶降解效率底及多种酶降解中酶最佳配比不详等问题；Q7-31分离自青藏高原，为丰富青藏高原真菌资源的基础研究提供蛋白质水平的信息。为丰富青藏高原真菌资源的基础研究提供基因、蛋白质水平的信息。

植物细胞壁是最丰富的生物质能源，植物病原菌镰刀菌能分泌一系列的植物细胞壁降解酶。镰刀菌Q7-31T能高效的降解植物细胞壁。本研究：1）利用比较蛋白组学技术对Q7-31T的粗酶液经双向电泳，有115个蛋白质在诱发条件下表达量明显增高。串联质谱测定得到40个阳性鉴定结果，共有28种蛋白质，其中包括糖苷水解酶10种、蛋白酶6种，氧化还原酶6种、酯酶2种、转移酶2种、ATP酶和功能未知的蛋白各1种。分别来自GH5、GH7、GH10、GH13、GH18和PL1家族，Q7-31T的植物细胞壁降解酶系较为复杂，其中GH7家族的Egn20和GH10家族的Xyn9分泌量的变化最明显。2）采用Sephacry S-100柱层析和DEAE交换柱层析对粗酶液28种蛋白，纯化得到内切葡聚糖酶Egn20，Egn21和Xyn9及蛋白酶M14等4种，，研究其酶学性质及酶促动力学特性。其中Egn20、Xyn9具有协同降解植物细胞壁的作用。3）确定了核心酶为GH5家族的Egn21，其分子质量为44.25 kDa，等电点为4.91；Egn21最适反应温度为40 °C，在45℃以下比较稳定。该酶最适pH为6.0，在pH为5.0-8.0条件之间比较稳定。Fe2+、Ca2+、K+、等有抑制作用，Hg2+会使酶失去活性，Km值为13.79 mg/mL。4）使用软件对这些酶进行生物信息学分析；将Q7-31T菌株植物细胞壁降解最关键酶归为：GH5家族内切葡聚糖酶、GH7家族内切葡聚糖酶、GH7家族外切葡聚糖酶和GH10家族内切木聚糖酶四类酶。这些相关酶类为中等分子量大小，二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲四种元件构成，其中无规则卷曲的数量最高；四种酶类均为亲水性酶，磷酸化位点比例较高，存在1-2个糖基化位点；四种酶都存在较高比例的催化结构域，三级结构呈中空的“C”字形。少量的糖基化位点、高比例的催化结构域、多变的三维构象、大量的磷酸化位点与高效的协同作用方式决定了Q7-31T菌株的植物细胞壁降解酶对细胞壁的高效降解。5）确立了Q7-31T胞外酶Egn20、Egn21降解模式及反应机制。Egn21降解棉花纤维产生裂缝平均大小为9.4 nm/min±4.5nm/min。综上所述，通过蛋白组学及酶学的研究对Q7-31T植物细胞壁降解酶系进行了系统的研究，揭示了其高效降解植物细胞壁的内在机制。