低温真菌产生的海藻多糖降解酶的研究

海藻多糖降解酶是能将海藻多糖降解成低聚糖和单糖的水解酶,它在医药、食品、能源工业和环境治理上有着广阔的前景。海藻多糖降解酶的研究起步较晚，主要集中于酶应用方面的研究。本项目以从单细胞棕囊藻（Phaecocystis sp.）分离的低温丝状真菌Ref1为材料，优化高产海藻多糖降解酶的培养条件，对粗酶进行提取、分离纯化、获得纯酶；弄清主要组份、酶的结构特性、酶学性质、酶促动力学特性等；从基因－蛋白质水平深入研究参与海藻多糖降解相关蛋白质或酶的结构与功能及其基因的表达调控规律； 耐低温真菌Ref1菌株及其产酶情况的及酶学理论研究，有助于揭示基因、蛋白质与海藻多糖之间关系，为其他类型的海藻多糖降解酶的机制研究提供借鉴；为其他类型的海藻多糖降解酶的机制研究提供借鉴；为通过生物工程手段提高海藻多糖降解酶活性的产量与质量提供理论依据。

本研究产海藻多糖降解酶的真菌为研究对象，验室筛选出的高产海藻多糖降解酶的4株菌，经研究发现其海藻降解酶和木聚糖酶同源，因此，选用木聚糖替代.对该4株真菌进行了分子及形态学鉴定，为镰刀菌Q7-31（Fusarium sp. Accession No:FJ646593）；木霉菌M50537（Trichoderma sp. Accession No: GQ249380）拟盘多毛孢菌50647（Pestacotiopsis sp. Accession No:GQ249381），单色革盖菌Cerrena unicolor Ref1 (Accession No: EU834831)根据菌种的特性，分别进行这些菌株的酶的分离纯化、酶学特性、基因克隆与表达、生物信息学分析、植物细胞降解等协同作用等方面的研究。.对单色革盖菌Cerrena unicolor Ref1的培养特性、产海藻多糖降解酶及木聚糖酶条件和酶学特性进行了研究。结果表明：该菌为低温型菌株，其最佳生长条件为pH6、20℃和酵母膏作为氮源；最佳产酶条件为pH3-7、15℃及以酵母膏氮源。.研究协同作用的四株真菌(镰刀菌属Fusarium sp.、木霉属Trichoderma sp.、曲霉属Aspergillus sp.、拟盘多毛孢属Pestalotiopsis sp.)液体发酵所产粗酶液单独及混合降解水稻秸秆活性比较研究，结果表明：无论是CMC酶活、木聚糖酶活，还是对水稻秸秆的降解活性，各菌株粗酶液混合后普遍表现出不同程度的协同作用。各菌株中，拟盘多毛孢菌的粗酶液的CMC酶活、木聚糖酶活都最高(分别达到了0.3149U/mL和38.4817U/mL),对水稻秸秆的降解能力也不错，为28.9490μg/mL。.Fusarium sp Q7-31木聚糖酶基因xyn8克隆，经生物信息学分析：该基因可编码一个分子量为25.7KDa的木聚糖酶，理论等电点为6.9，该木聚糖酶属于G11家族。将木聚糖酶基因xyn8连入质粒pGEX-5x-1，构建表达载体pGEX-5x-1-xyn8，转化大肠杆菌BL21(DE3)。异源表达蛋白通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定，亲和层析纯化，并且对重组木聚糖酶的酶学特性进行了研究。底物特异性结果表明：重组木聚糖酶能特异性降解木聚糖，但是对淀粉和CMC无活力。