促进肿瘤凋亡的融合蛋白CPP-TRAIL-ARTS C27的制备及机制研究

Apoptosis evasion is the main reason of tumourgenesis and progression. TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) can induce apoptosis selectively in cancer cells while sparing normal cells. However, many cancer cells are resistant to TRAIL-induced cell death. Targeting XIAP as a therapeutic strategy in sensitiizing TRAIL-induced apoptosis in cancer cells. Apotosis related protein in TGF-beta siganaling pathway (ARTS) is a mitochondrial protein that promotes apoptosis through binding to and antagonizing XIAP.We assume that cell penetrating peptide may make ARTS and TRAIL fusion protein penetrate into tumor cells, promoting apoptosis and reversing the drug resistance of the tumor efficiently.On the basis of our previous work, we fuse cell penetrating peptide with the TRAIL and ARTS C27 to play a targeted pro-apoptotic role, which may serve as new therapeutic targets and provide a new thought to explore the mechanism of apoptosis of tumors.

凋亡逃避是恶性肿瘤发生发展及治疗耐受的主要原因。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）因具有极好的靶向性及较少的副作用，成为极具潜力的抗肿瘤药物。但凋亡途径中任一环节的改变也可导致TRAIL耐药，因此，内源性及外源性双途径同时促凋亡将有力解决部分肿瘤细胞耐药问题。TGF-β信号通路的凋亡相关蛋白（ARTS）因可抑制XIAP而通过内源性途径促进凋亡而受到关注。如果能穿透细胞膜靶向输送促凋亡蛋白到达肿瘤细胞胞浆，则可高效地起到促凋亡作用。本项目在既往工作基础上，利用细胞穿膜肽CPP与蛋白TRAIL及ARTS C27融合，发挥靶向促凋亡作用。本研究为开发新的肿瘤靶向药物，探索促肿瘤细胞凋亡的新思路奠定基础。

凋亡逃避是恶性肿瘤发生及耐药的主要原因，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体具有较好的靶向性及较少的副作用，为二十年来极具潜力的在研抗肿瘤药物。国际上多个凋亡受体激动剂在临床试验中因为（1）温和的抑瘤作用；（2）有限的治疗反应；（3）部分病例缺乏临床受益而处于停滞状态。.项目完成了TRAIL穿膜肽样突变体和TRAIL穿膜肽融合蛋白两类28个突变体基因表达载体的构建和表达，获得了蛋白样品。采用50余株肿瘤细胞系对样品进行体外生物活性筛选，得到了TRAIL-Mu3、TRAIL-MuR5、TRAIL-MuR6、MuR5S4TR和MuR6S4TR 5个具有优良活性的蛋白质。项目建立了TRAIL-Mu3和MuR5S4TR两个蛋白中试制备工艺，进行了裸鼠移植瘤模型抗肿瘤试验。.细胞水平及动物水平进行了突变体的流式细胞术，FITC荧光标记细胞穿膜作用，凋亡信号通路因子，配体受体亲和解离曲线分析，死亡受体DR4/DR5，不同阶段凋亡酶Caspase s，凋亡抑制因子XIAP表达分析等机理研究。.结果表明，与野生型TRAIL相比，TRAIL-Mu3和MuR5S4TR具有：（1）更高的抑瘤作用，对于敏感细胞其生物活性提高了10000倍；（2）更高的药物敏感率，对随机选择的32株肿瘤细胞的敏感率近80%（野生型TRAIL为40%）；（3）更高的安全性，TRAIL-Mu3和MuR5S4TR单次给药1000~1500mg/kg时，小鼠未达到最大耐受量。TRAIL-Mu3及MuR5S4TR能明显抑制人肺癌、结直肠癌、胰腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长，其特点为：（1）单用抑瘤作用强于临床一线化疗药物，如紫杉醇、吉西他滨等，单用抑瘤率超过80%；（2）作用持久，全疗程持续抑制肿瘤的生长；（3）动物无死亡及临床可见的不良反应，治疗中动物体重增长。体内外作用显示TRAIL-Mu3和MuR5S4TR具有较高的受体亲和力，能穿透细胞膜进入细胞浆，具有穿膜作用，同时上调肿瘤细胞死亡受体DR4/DR5，提高凋亡各个阶段Caspases的表达，部分肿瘤细胞下调凋亡抑制因子XIAP的表达。.综上，本研究采用新思路、建立新方法，获得了TRAIL-Mu3和MuR5S4TR两个优良抗肿瘤候选蛋白质，在治疗效果、安全性、成药性方面具有较大优势，值得深入进行应用开发及机理研究。