免疫双特异抗体联合超声微泡介导内皮祖细胞移植促进血管新生

细胞心肌成形术是将有增殖能力的细胞移植入梗死心肌内替代坏死心肌以恢复正常心肌功能,是目前促进不可逆心肌损伤再生的一种全新治疗方法。针对血管新生干细胞移植存在的安全性、效应性、投递途径存在等方面的问题，本项目拟开发一种新型的干细胞靶向移植技术，应用免疫双特异抗体联合超声破坏微泡技术介导内皮祖细胞移植促进缺血心肌内血管新生。首先构建抗肌凝蛋白轻链/CD34双特异性抗体，从外周血液中分离内皮祖细胞(EPCs)，并在EPCs表面装配该双特异性抗体。然后运用超声靶向破坏大鼠梗死心肌内的微泡，其产生的空化效应和机械效应可使梗死周围缺血心肌内的微环境发生改变（如细胞粘附分子表达的增加），再从静脉输入标有双抗的EPCs，双特异抗体可在EPCs与缺血心肌间形成一抗体连接桥，从而促进EPCs在大鼠缺血心肌内的靶向转移，诱导血管新生，为探讨一种新型的靶向细胞移植方法提供科学依据。

按照项目书2010.01-2012.12研究计划，本课题组经过3年的努力，顺利完成课题预期目标；已发表SCI论著3篇，CSCD期刊论著11篇，综述5篇；完成3名博士研究生和2名硕士研究生的培养。具体成果简述如下：. 1.采用Percoll密度梯度离心法和差速贴壁结合法，成功在体外分离、诱导培养大鼠骨髓来源的EPCs(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)，以形态学、免疫学、功能学等方法进行培养细胞鉴定，并以5-BrdU标记EPCs，结果显示5-BrdU标记EPC不影响细胞增殖活性，经过体外诱导培养的EPCs已具备了成熟内皮细胞的某些功能特点。由此成功建立了一种稳定可靠、纯度较高的SD大鼠骨髓内皮祖细胞分离、鉴定并诱导培养成血管内皮细胞的方法。. 2.通过化学偶联法成功制备抗肌凝蛋白轻链/CD34双特异性抗体（BsAb）。分别将不同浓度的FITC标记的BsAb与EPCs混合，在荧光显微镜及流式细胞仪下观察抗体与细胞的结合情况，以筛选出抗体装配的最佳浓度为50ngBsAb/106个细胞，成功装配BsAb和EPCs。. 3.成功探讨了超声破坏微泡对促进BsAb标记的EPCs向缺血心肌定向移植的可行性和治疗效果。通过超声靶向破坏大鼠梗死心肌内的微泡后，静脉输入标有BsAb的EPCs，分析移植30天后结果。（1）EPCs+ BsAb+US+MB组大鼠不仅在心肌5-BrdU免疫染色阳性细胞明显高于MI组，同时大鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(FS)及每搏量（SV）等左心室收缩功能指标明显优于其他各组。（2）Ⅷ因子免疫组化染色显示，EPCs+ BsAb+US+MB组毛细血管数较其他各组多。（3）EPCs+ BsAb+US+MB组VEGF和SDF-1的mRNA水平和蛋白表达水平均与MI组有显著差异。证实BsAb与超声破坏微泡技术联合使用，可以促进EPCs向大鼠缺血心肌转移，改善心脏功能，促进血管新生。