脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导仔猪神经损伤的分子机制研究

Deoxynivalenol(DON) is one of the secondary metabolites of the Fusarium and extensively existed in agricultural products and feed, determined as one of the most dangerous natural food contaminants by the WTO. DON has a great damage to human beings and animals, and studies have shown that DON is a neurotoxic substance, while the mechanism of neurotoxicity is unknown because of the neural complexity.In our study, the piglets, the most sensitive experiment animals to DON, are selected as the research object, and RT-PCR, flow cytometry, ELISA, HPLC, single cell gel electrophoresis, neuronal cells cultures in vitro are used in this test. In order to reveal the molecular mechanism of nerve injury induced by DON in cellular and overall level, the concentration of DON in brain tissues and nerve cells, calcium homeostasis, neurotransmitter secretion, lipid peroxidation, DNA damage and apoptosis will be studied, combined with the observation of nerve tissue and cell ultra microstructure and nerve fiber tangles. The research results of this project will provide a theoretical basis to remove DON neurotoxicity.

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是由镰刀菌属病原真菌产生的次级代谢产物之一，广泛存在于农产品和饲料中，被世界卫生组织确定为最危险的自然发生食品污染物，对人类和动物的危害巨大。研究表明，DON是一种神经毒性物质，然而由于神经系统的复杂性，目前DON引起动物神经毒性的作用机制仍不完全清楚。本项目以对DON最敏感的仔猪为研究对象，拟运用RT-PCR、流式细胞术、ELISA、HPLC、单细胞凝胶电泳、体外神经细胞培养等技术，研究DON染毒猪脑组织与培养的神经细胞中DON的蓄积量、钙稳态、神经递质分泌、脂质过氧化、DNA损伤及细胞凋亡等的变化，结合神经组织和细胞超微结构及神经纤维缠结的观察结果，旨在从细胞和整体水平上揭示DON诱导仔猪神经损伤的分子机制，为DON神经毒性危害的解除提供理论依据。

本研究项目从细胞和整体水平上揭示了脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）诱导仔猪神经、免疫及肠道炎性损伤的分子机制。试验一方面通过体外培养PC12细胞、仔猪海马神经细胞及猪肠道上皮IPEC-J2细胞，借助现代毒理学研究方法，从细胞形态、神经递质含量、钙稳态及脂质过氧化的变化、细胞凋亡、细胞自噬、凋亡与自噬的关系等，深入研究DON诱导PC12细胞、仔猪海马神经细胞及IPEC-J2细胞的毒性作用机制；另一方面通过断奶仔猪DON体内暴露试验，从组织方面研究了DON对断奶仔猪脑组织脂质过氧化及神经损伤作用，此外对断奶仔猪机体免疫功能以及小肠炎性损伤的作用机制进行了更深一步的研究。结果显示，DON暴露对PC12细胞和仔猪海马神经细胞具有明显的毒性作用，可引起细胞形态发生改变，细胞存活率降低，细胞膜和细胞器损伤、胞质空泡化、细胞核皱缩，产生了双层或多层膜包裹的自噬小体和晚期自噬溶酶体结构，通过MAPKs信号通路诱导仔猪海马神经细胞凋亡，可以诱导仔猪海马神经细胞发生自噬，并证明PI3K/ Akt/mTOR信号通路参与并介导了细胞自噬现象，同时可以诱导PC12细胞发生自噬，且Class Ⅲ PI3K/ Beclin-1/Bcl-2信号通路参与并介导了细胞自噬现象，且自噬延缓了PC12细胞和仔猪海马神经细胞凋亡，为细胞凋亡担任了保卫角色；同时DON对断奶仔猪脑组织产生不同程度的病理损伤，在脑组织脂质过氧化方面，DON可以使脑组织内5-HT、ACH、GABA、NE的含量升高，并降低CAT、SOD、GSH-Px的活性降低，DON通过下调CAM和CAMKⅡ mRNA的表达量从而影响脑组织中的钙调通路；另外，DON暴露可使断奶仔猪的生长性能降低、免疫器官指数降低，同时降低IgA、IgM、IgG的基因及蛋白表达水平；通过体外和体内两个方面的试验，发现暴露于DON后，仔猪小肠上皮细胞及小肠黏膜均发生病理损伤、炎性因子水平及基因表达量升高等现象，同时上调NF-κB通路关键点及上下游因子的基因及蛋白的相对表达量，表明DON可经NF-κB炎症信号通路诱发小肠上皮细胞产生炎症损伤反应。