一个小麦新型金属转运蛋白基因的克隆与功能分析

植物中，微量金属元素作为许多功能蛋白的辅因子参与多种重要的生理代谢过程，微量元素的平衡对于植物生长发育起重要作用。我们通过cDNA-AFLP技术从模拟干旱胁迫的小麦cDNA中克隆到一个受干旱胁迫强烈诱导的基因片段，并采用RACE方法获得了该基因的全长cDNA序列。数据库搜索和序列比对证明该基因是一个功能未知的新基因。生物信息学预测该基因的编码蛋白具有12个典型的跨膜结构域。进一步的胁迫表达表明，该基因还能够被金属离子，尤其是铜离子的诱导而上调表达，定名为TaMT1。酵母生长实验显示，在分别含有高浓度Cu（0.5mM）、Mn(15mM)及Zn(5mM)的培养基上过量表达TaMT1的转基因酵母生长受到明显抑制。本研究拟进一步克隆小麦不同基因组（A，B，D）中的TaMT1成员，验证各成员在金属转运和抵御干旱胁迫中的生物学功能，并系统解析该基因的功能结构域。

铜离子是植物生长必须的微量元素之一，但是在过量情况下会对植物生长造成伤害。我们通过cDNA-AFLP差异显示和cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA end, RACE)，在小麦cDNA中克隆得到一个含有3个成员的铜转运蛋白家族，命名为TaCT1 (Triticum aestivum Copper Transporter 1, TaCT1)。通过中国春缺体-四体定位，发现3各成员分别定位于5A、5B和5D染色体上，因此对三个成员分别命名为TaCT1-5A, TaCT1-5B和TaCT1-5D。蛋白结构预测表明，TaCT1-5A, TaCT1-5B和TaCT-5D均含有12个跨膜结构域，属于MFS (major facilitator superfamily) 家族。与已有报道的两类Ctr类铜转运蛋白和P型ATP酶(P-type ATPases)类铜离子转运蛋白相比，在结构上TaCT1属于一个新类型的铜离子转运蛋白。点突变表明，TaCT1蛋白与Ctr类铜转运蛋白和P型ATP酶类铜离子转运蛋白具有类似的功能基序，Met35、Met38和Cys365同时突变可抑制TaCT1蛋白的功能。表达TaCT1-5A基因的酵母在正常培养和在外加铜离子的情况下都能够比对照菌株富集更多的铜离子，而且表达TaCT1基因的酵母在过量铜、锌、或锰离子的培养基上生长受到抑制。在小麦植株中，过量铜、锌离子抑制TaCT1基因在叶片中表达，在根中TaCT1的表达特异受到铜离子的抑制；通过病毒诱导的基因沉默系统(virus induced gene silencing, VIGS)，研究了TaCT1基因在小麦植株中的功能。TaCT1基因下调表达植株在正常水培条件以及外加铜离子情况下，均减少了铜离子的吸收，而且增强了对铜离子毒害的耐受能力，表现为叶片鲜重明显高于对照植株。在拟南芥原生质体和洋葱表皮细胞中，GFP标记的TaCT1-5A蛋白共定位于高尔基体的标签蛋白Man49，表明TaCT1基因定位在高尔基体。离体叶片失水速率实验及干旱实验表明，TaCT1可能参与小麦的干旱胁迫信号途径。综合以上结果，推测在小麦中TaCT1基因参与了以高尔基运输系统为基础的铜离子吸收和转运。