SPIO介导BMP2基因转染牙髓干细胞与SPIO-CPC构建组织工程骨的成骨能力及MRI监测

Successful tissue engineered bones should be designed to include a combination of scaffolds, stem cells and cytokines. In this study, scaffolds and stem cells will be improved and modified by superparamagnetic iron oxides nanoparticles (SPIO) before constructing tissue engineered bone. It is the first time to use of SPIO as both gene delivery system and MRI contrast agent. Dental pulp stem cells (DPSCs) will be gene transfected with bone morphogenetic protein 2 (BMP2) and magnetic marked at the same time by the application of SPIO. The gene modified DPSCs can express BMP2 stably for a long time, while they can be detected by magnetic resonance imaging (MRI). Secondly, calcium phosphate cement (CPC) will be improved by SPIO addition. The modification can endow CPC superparamagnetic properties and micro-nano-structure which is more similar to the morphology of extracellular matrix, so as to achieve enhanced physical and mechanical properties, and better cell adhesion, proliferation and differentiation behaviors. Additionally, the magnetic scaffolds can be the targets of magnetic marked cells. Finally, tissue engineered bone will be constructed with gene-modified DPSCs and nano CPC. Bone regeneration effects will be detected and DPSCs will be tracked noninvasively by MRI. The mechanisms of tissue engineered bone construct on bone repair will be explored. This will give new ideas on real time in vivo tracking of seed cells, and provide new inspiration for the construction and characterization of tissue engineered bones.

成功的组织工程骨是支架材料、种子细胞与细胞因子三者的有机结合。本研究从基因修饰干细胞、纳米改良支架以及组织工程骨构建三方面对组织工程骨进行全面改良。首次利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIO）同时作为基因递送载体和MRI造影剂，介导BMP2基因转染牙髓干细胞（DPSCs）实现基因传递和磁性标记的双重功能，使种子细胞长期稳定表达BMP2且MRI可检测。其次，以SPIO改良磷酸钙骨水泥（CPC）赋予其超顺磁性和更加接近细胞外基质形貌的微纳米结构，提高其物理机械性能，并促进种子细胞的黏附、增殖和分化，独特的磁力作用还可吸附磁性标记后的种子细胞而实现磁性靶向。最后，用基因修饰的DPSCs与纳米CPC复合构建组织工程骨，检测其骨修复能力并用MRI无创性在体追踪植入的DPSCs，探索组织工程骨复合体对骨修复的作用机理。这将为组织工程骨的构建、表征，以及植入细胞的无创性实时监测提供新思路。

成功的组织工程骨是支架材料、种子细胞与细胞因子三者的有机结合。本项目主要研究：（1）SPIO-CPC复合组织工程支架的制备；（2）SPIO的添加量对CPC性能影响的研究；（3）SPIO的不同添加方式对CPC成骨活性影响的研究；（4）外磁场对SPIO-CPC成骨活性影响的研究。. 第一部分，用CPC粉与SPIO水溶液混合制备纳米CPC，同时添加一种没有磁性的纳米铁制备样品进行对照，对所制备获得的纳米CPC进行物理化学性能检测、细胞相容性和成骨活性的体外和体内实验检测。结果发现：成功制备了SPIO-CPC复合支架材料；SPIO-CPC具有良好的生物相容性和成骨活性；SPIO-CPC促进成骨的主要机制是SPIO-CPC的微纳米表面结构，释放的纳米铁被细胞吞噬，磁性作用不是促进接枝其上的干细胞骨向分化的主要因素。在大鼠下颌骨骨缺损模型中，SPIO-CPC与对照组相比可以更好地促进新骨形成。. 第二部分，将不同含量的SPIO添加到CPC中，检测所制备SPIO-CPC的物理化学性能、细胞相容性检测和成骨活性，并探索其促进干细胞骨向分化的机制通路，主要是对WNT通路的影响。结果发现：在所设定的添加含量中，0%，1%，3%，6%中，3%添加量的SPIO-CPC表现出最好的成骨性能；WNT/β-catenin通路的激活是SPIO-CPC增强干细胞成骨活性的机制之一。. 第三部分，探索将SPIO添加进粉和添加进液的添加方式，以及在添加进粉相时联合使用壳聚糖溶液，在体内外对磷酸钙骨水泥成骨活性的影响。检测样品的物理化学性能，细胞相容性和对干细胞分化的作用。将各组样品植入小鼠皮下，评价动物体内相容性。结果发现：SPIO以颗粒或者溶液形式添加进CPC均可以制备成生物相容性好且成骨活性好的纳米复合支架材料；SPIO作为液体的添加比粉体具有更好的生物活性；与单独添加SPIO相比，联合使用壳聚糖溶液能够更好地增强CPC。. 第四部分，将第一部分中制备的SPIO-CPC结合外部静磁场作用并检测其对干细胞成骨分化的作用。结果发现：SPIO-CPC协同外磁场可以更加促进干细胞的成骨活性；增强机制主要是由于磁场的物理力和释放纳米铁被细胞内吞。. 本项目所获得研究结果将为组织工程骨的构建、表征提供新思路。