运输应激猪热休克蛋白表达规律及应对应激损伤的分子机制

利用组织学、免疫组织化学、ELISA、荧光定量RT-PCR和计算机图像分析等技术，本项目拟以应激时组织细胞中诱导型Hsps（Hsp72、Hsp86、Hsp27）作为研究对象，同时研究运输应激猪重要器官心脏（心力衰竭）、肾脏（休克肾）、胃（应激性溃疡）等组织细胞和在相对单一应激条件下离体培养的热应激处理猪组织细胞（心、肾）中Hsps及其相应hsps mRNA表达的特点及消长规律、热休克转录因子调控Hsps的机制、Hsps表达量的变化规律与组织细胞应激性病理损伤及其损伤程度的相关性等，比对生物机体细胞和离体培养细胞因受到应激刺激而出现的组织细胞指征改变，深入研究生物逆境状态下Hsps表达及其规律对组织细胞抗应激损伤的分子机理，提出抗动物运输应激的措施。

本研究选取皮特兰和二花脸杂交二代仔猪20头，随机分成4组，一组作为对照组饲养在正常饲养环境中，其余三组在常规路段分别进行1 h、2 h和4 h的运输。运输结束后，剖杀所有运输组和对照组猪，分离血清，检测血清生化指标丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）。采取心脏、肝脏、胃和背最长肌，用于组织病理学检测、ELISA和荧光定量RT-PCR研究。同时培养原代大鼠心肌细胞，分别进行10 min、20 min、40 min、60 min、120 min、240 min、360 min、480 min的热应激处理，然后对各组心肌细胞分别进行免疫组织化学、Western blot、荧光定量RT-PCR等检测。结果显示，运输应激后心脏实质细胞表现出以急性退行性变化为主要特征的急性损伤。心脏和肝脏细胞的损伤在运输1 h后最明显，Hsp27和αB-crystallin的表达在猪的运输过程中显示出了组织特异性。运输应激后猪胃脏黏膜皱褶上的主细胞有不同程度的脱落，运输2 h后，胃组织中的Hsp90表达量显著下降,但经过1 h、2 h和4 h运输后，各组猪胃脏中Hsp70水平均显著高于对照组。胃中αB-crystallin的表达在运输4 h后显著高于对照组。调节HSPs表达的HSF-1的水平在运输过程中基本保持稳定，提示在运输应激过程中，HSF-1不是调节HSPs表达的唯一因素。体外试验结果显示，在持续热应激后，大鼠心肌细胞受到一定的损伤。在热应激过程中，Hsp27在心肌细胞中有入核现象，HSF-1则相对稳定的分布于细胞核中。Hsp27的表达在热应激8 h后显著升高，HSF-1的表达在热应激10 min、40 min、60 min和120 min时显著降低，而在240 min后极显著升高。hsp27 mRNA和hsf-1 mRNA在热应激10 min后均显著或极显著升高。Hsp27在热应激过程中发挥一定的作用；Hsp27和HSF-1的表达与其相应mRNA水平不同步，可能与其在热应激过程中被磷酸化有关。热应激处理20 min后，Hsp110的表达量呈显著上升趋势，并且在热应激处理240 min后，Hsp110的表达量比对照组提高约1.2倍；免疫组织化学结果显示，颗粒状Hsp110分布于心肌细胞的胞浆与细胞核内，4