利用人BLM-DNA解旋酶活性抑制模型研究戴氏虫草抑制肿瘤干细胞生长的机制

Human BLM DNA helicase is a new target for the cancer chemotherapitic agents.Based on our previous researches, it is proposed by us that micromolecule compounds will be extracted with the different organic solvents and purified with the different column chromatography from Cordyceps taii. The vector for expressing recombinant human BLM helicase in Escherichia coli will be constructed with with pET-15b plasmid and BLM helicase will be expressed in Escherichia coli cultured in LB and purified by using nickel affinity chromatography. Tumor stem cells will be cultured in serum-free medium and sorted by using FACS for sorting side population. In order to screening cancer chemotherapitic micromolecules from Cordyceps taii, inhibition of the micromolecules resulted on ATP hydrolysis, DNA binding and DNA unwinding of human BLM helicase will be detected by using fluorescence polarization etc and inhibition of the micromolecules on growth of tumor stem cell will be detected by using colony formation and MTT assay etc. The mechanisms for antiproliferative effect of the micromolecules on tumor stem cells will be elucidated by dictation for human BLM helicase activity, apoptosis, DNA damage and cell cycle. It is to be observed for the anticancer therapeutic effect of the micromolecules on tumor-bearing nude mice. Identification and analysis of its chemical structure will have been done. The human BLM helicase model and inhibiting tumor stem cell model will have been established for screening of anticancer drugs and its anti-tumor mechanism will be clearly clarified after the completeness of the project proposed by the applicants.

人BLM-DNA解旋酶是抗癌药物的新靶点。在以前的研究基础上，本项目组拟采用溶剂法、柱色谱法等从戴氏虫草中分离纯化小分子化合物；采用pET-15b质粒构建大肠杆菌表达人BLM解旋酶基因表达载体，运用细菌培养、镍亲和层析法等表达分离纯化人BLM解旋酶；无血清培养和流式细胞仪分选侧群肿瘤干细胞；用荧光偏振法等分别检测戴氏虫草小分子化合物对人BLM解旋酶的 ATP水解、DNA链结合、解旋活性的抑制作用，用细胞集落形成法和MTT法等检测上述小分子化合物对肿瘤干细胞生长的抑制作用；以上述指标从戴氏虫草中筛选抑制肿瘤干细胞生长的活性成分；以人BLM-DNA解旋酶活性抑制、肿瘤干细胞凋亡、细胞DNA损伤和细胞周期变化等阐明其抑制肿瘤干细胞生长的机制；观察其对荷瘤裸鼠的治疗效果。鉴定和分析其化学结构。本课题完成将建立利用人BLM解旋酶抑制分子模型和肿瘤干细胞模型筛选抗癌药物的方法并阐明其抑瘤作用机制。

“利用人BLM-DNA解旋酶活性抑制模型研究戴氏虫草抑制肿瘤干细胞生长的机制”的课题任务下达后，课题组根据项目计划开展了如下4个方面研究并取得了一定进展：.一、乳腺癌干细胞的特征及其RecQ解旋酶表达.完成了乳腺癌干细胞的筛选培养与鉴定，实时荧光定量PCR检测RecQ家族解旋酶mRNA在不同细胞中表达水平，RecQL，BLM，WRN在肿瘤干细胞中表达较MDA-MB-435明显下降 ，相反，RecQ4，RecQ5在肿瘤干细胞表达较MDA-MB-435明显升高 。MDA-MB-435肿瘤干细胞中BLM解旋酶蛋白表达量比MDA-MB-435细胞低；MDA-MB-435肿瘤干细胞中RecQ4解旋酶蛋白表达量比MDA-MB-435细胞高。.二、 戴氏虫草抗肿瘤有效成分提取与分离纯化及其抑瘤作用.分离得到6个化合物，分别为化合物1(反式-16-十八碳烯酸)、化合物2（壬二酸）、化合物3（5α, 8α-麦角甾-6, 22-二烯-3β-醇）、化合物4(亚油酸甲酯)、化合物5(亚油酸)和化合物6(十七-烷醇)。抑瘤活性检测表明，壬二酸对舌癌Tca-8113细胞增殖具有较高的抑制活性，5α, 8α-麦角甾-6, 22-二烯-3β-醇对乳腺癌MDA-MB-435细胞和BT474细胞具有较高的抑制细胞增殖活性。.三、汉防己甲素、乙素衍生物影响RecQ解旋酶活性和抗肿瘤研究.汉防己甲素衍生物HL-42和HL-49可明显抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖并诱导其凋亡，作用机制可能是HL-42和HL-49部分阻断了细胞内DNA损伤修复通路。汉防己甲素衍生物HL-49可以有效增加三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的化疗敏感性。HL-42、HL-49对乳腺癌干细胞增殖有抑制活性。 汉防己甲素衍生物能影响BLM解旋酶的DNA结合活性和DNA解链活性 .四、BLM基因编辑实验研究.发现采用CRISPR-CAS9敲除BLM基因后抑制MDA-MB-231细胞增殖。敲除BLM基因后增加MDA-MB-231细胞凋亡。.本项目研究所取得的结果已经公开发表中文论著7篇，其中5篇发表于中文核心期刊。项目研究所取得的部分结果支持了发明专利“双苄基异喹啉衍生物及其在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途”已经向中华人民共和国国家知识产权局申报。培养8名硕士研究生毕业获得学位。