以ZT复合物为载体的新型长效GLP-1的设计及其生物活性研究

The incidence of type 2 diabetes mellitus (T2DM) gradually increases in recent years, and has become a serious threat to human health. Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) with the activity of lowering glucose level has attracted considerable interest as a therapeutic agent for the treatment of T2DM. A major limitation to the therapeutic use of the native GLP-1 is its very short half-life (1-2 min) in circulation, because of the rapid cleavage by the proteolytic enzyme and the renal clearance. The Z1Z2/Telethonin (ZT) complex is super stable in human body. This program plans to develop a series GLP-1 analogues by genetically fused different number of GLP-1 molecules (one, two or three) to the ZT complex via linkers, forming the fusion protein GLP-ZT. The stability and the biological activity of GLP-ZT will be tested in vivo and in vitro. And then, the half-life of the GLP-ZT will be further prolonged by FcRn-mediated recycling system via fusion of albumin-binding domain (ABD035). The aim of the program is to reveal the stabilities and the biological activities of the different GLP-ZT, to clear the half-life extension effect of the ZT complex on GLP-1, to illuminate the relationship between the GLP-1 molecule number, linker and the half-life, activity, to explore the synergistic effect of the ZT complex and ABD035 on half-life extension. All these results will lay soil foundations for further develop new long-acting therapeutic drugs for T2DM.

2型糖尿病发病率逐年增高，严重威胁了人类健康。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是一种重要的降血糖多肽，但其在体内受到蛋白酶的降解及肾脏的过滤排出，导致半衰期较短（1-2分钟），无法直接用于糖尿病治疗。本项目拟以人体内高稳定性肌肉蛋白Z1Z2/Telethonin（ZT）复合物为载体，基于其具有3个N端的特性，以基因融合的方式，通过连接肽与不同数量的GLP-1（1-3个）进行连接，获得融合蛋白GLP-ZT；然后，以体外与体内相结合的方式对其稳定性及活性进行比较研究；并通过白蛋白结合结构域（ABD035）间接利用FcRn的循环再生机制进一步延长其半衰期。本项目旨在揭示不同GLP-ZT的稳定性及降血糖活性，明晰ZT复合物对GLP-1半衰期的延长作用，阐明GLP-1分子数量、连接肽与降血糖活性、半衰期的关系，探讨ZT复合物与ABD035在半衰期延长方面的协同作用，为研发长效糖尿病治疗药物提供依据。

随着生活水平的提高和饮食结构的改变，2型糖尿病的发病率逐年增加。研究发现，胰高血糖素样肽-1（GLP-1）具有显著的降血糖活性，能够用来治疗2型糖尿病。但是GLP-1在体内受到蛋白酶的降解和肾脏的过滤排出作用，半衰期很短，只有1-2 min，严重限制了其在临床上的应用。本项目以人体内高稳定性肌肉蛋白Z1Z2/Telethonin（ZT）复合物为载体，采用基因融合的方式对GLP-1进行改造（GLP-ZT），以延长GLP-1的半衰期，增加其在体内的治疗效果。并通过白蛋白结合结构域（ABD035）间接利用FcRn的循环再生机制进一步延长其半衰期。本项目的研究结果如下：1）通过基因融合的方式将GLP-1与ZT载体进行连接，成功在大肠杆菌中实现可溶性表达；2）对GLP-1的分子数量及中间连接肽的长度和刚性程度进行优化，通过体外细胞活性实验与体内降血糖实验证明，2GLP-GS-ZT-L3的活性最高（与EA linker类似），能在48 h内显著降低小鼠的血糖水平，其控制血糖时间是利拉鲁肽（每天注射一次）的6倍；3）在大鼠体内的半衰期达到了6-10 h，显著高于原始GLP-1分子；4）将白蛋白融合蛋白ABD035与2GLP-GS-ZT-L3进行融合，制备2GLP-ZT-ABD035融合蛋白，其能在96 h内显著降低db/db 2型糖尿病模型小鼠的血糖水平；5）2GLP-ZT-ABD035融合蛋白在大鼠体内的半衰期达到15-20 h，显著高于未加ABD035的半衰期。本项目明晰了ZT载体可以显著延长GLP-1的半衰期；探究了连接肽的长度及刚性程度对融合蛋白活性的影响；阐明了ZT复合物与ABD035之间具有协同作用，进一步提高了GLP-1的半衰期和降血糖活性。本项目揭示了ZT载体在长效蛋白质药物研发方面的重要应用前景，也为基于GLP-1的长效抗糖尿病药物的研发奠定了理论基础。