结核分枝杆菌压力反应因子SigC介导的分子致病机制研究

研究显示，sigC仅存在于致病分枝杆菌中，基因敲除sigC 的结核分枝杆菌毒株在小鼠与豚鼠体内毒力明显丧失，提示SigC与结核杆菌致病性密切相关，然而其分子机制尚不明了。此前，我们基因组学研究发现无毒株H37Ra sigC基因上游启动子存在突变，并推测可能与其体内减毒相关。接着，我们应用定量RT-PCR和报告基因表达方式均直接证明了该启动子突变确实引起了H37Ra在细胞内生长过程中sigC基因表达下调，故我们拟在此基础上进行深入研究。拟利用M.smegmatis和H37Ra构建不同SigC表达强度的Knock-in菌株，并综合应用荧光定量RT-PCR、Microarray、免疫共沉淀、双向蛋白电泳及质谱等技术分析其在体外和巨噬细胞内受SigC调控的基因差异表达情况，旨在分析和鉴定与SigC相互作用的关键蛋白和受其调控的毒力基因或调控因子，从而在分子水平解析SigC介导的结核杆菌致病机制。

已知SigC因子参与众多与结核分枝杆菌细胞加工过程相关重要基因的表达调控，基因敲除SigC则导致有毒株在小鼠或豚鼠体内毒力丧失，且SigC因子仅在致病分枝杆菌(如结核杆菌、M. leprae等)中存在，而在非致病分枝杆菌(如M. smegmatis)中缺失，这些均提示SigC因子与结核杆菌致病性密切相关。我们早期的基因组学研究解析了结核杆菌无毒株H37Ra的完整基因组序列并发现sigC基因启动子部位存在点突变，作为一个整体代谢调节因子，我们推测该启动子突变可能会影响其转录水平，而SigC表达量的改变则可能会直接或间接影响结核杆菌某些毒力相关基因的转录调控，从而引起H37Ra菌株毒力的改变。为此，我们分别应用荧光定量RT-PCR和启动子活性分析实验证明了H37Ra sigC基因及其启动子活性尽管在体外表达增高，却在体内表达下调。接着，我们系统构建并完善了分枝杆菌同源可控、定向表达等多种不同高效表达系统，可实现结核杆菌蛋白在分枝杆菌中以不同的水平及不同方式进行表达。同时，我们以M. smegmatis (相当于sigC Knock-out菌株) 和H37Ra (相当于sigC Knock-down 菌株)为模式菌，利用上述表达系统构建了SigC过表达的Knock-in菌株，将重组菌株体外培养后制备总蛋白，以双向电泳(2D-PAGE)分离差异表达蛋白并以质谱分析受SigC调控的蛋白表达情况，结果表明在SigC过表达的重组M. smegmatis和重组H37Ra菌株中分别鉴定出了9个和10个差异表达蛋白，这些蛋白多为分枝杆菌代谢过程中的一些关键酶类。接下来，我们还通过免疫共沉淀分析了与SigC相互作用的蛋白，结果并未检测到该类蛋白，提示SigC不是在翻译水平进行调控的。最近有研究鉴定了sigC的两个启动子序列并证实了sigC是在转录水平受调控且非自我调控(Chang A, Smollett KL, et a1. Tuberculosis. 2012;92(1): 48-55)，因而使得我们在蛋白水平分析与SigC相互作用蛋白的种种努力不得不终止。不过，我们还可构建H37Rv的sigC基因敲除菌株，分析其在缺氧、PBS饥饿、酸性、H2O2等不同环境压力下的差异基因表达情况或感染巨噬细胞前后炎性细胞因子表达的改变情况，尝试从压力环境条件下解释SigC的可能毒力机理。