SKA1基因在骨肉瘤原发耐药中的作用机制研究

骨肉瘤的恶性程度高，预后差。化疗原发耐药阻碍其疗效提高，由于缺乏合适的研究模型，原发耐药相关研究进展甚微。.我们对19例新鲜活检标本原代培养并传代成株，发现了具备原发耐药特性的SF-86和化疗敏感的NC-04细胞株，并建立了原发耐药骨肉瘤裸鼠模型（专利号：201010110746X）。.通过对SF-86和NC-04细胞进行全基因组表达谱基因芯片对照分析，初步筛选出50个潜在的原发耐药相关分子，随后建立shRNA慢病毒RNAi文库进行功能验证，发现SKA1基因显著影响SF-86细胞对多种化疗药物的耐药功能，提示SKA1基因在骨肉瘤原发耐药中起重要作用，而目前未见相关报道。.本项目拟深入研究SKA1基因抑制后下游基因转录、通路蛋白表达的改变，明确SKA1显著调控的信号通路与下游靶分子，利用GST pulldown技术联合质谱鉴定SKA1相互作用的蛋白，从而阐明其发挥耐药功能的分子机制。

骨肉瘤的恶性程度高，预后差。化疗原发耐药阻碍其疗效提高，由于缺乏合适的研究模型，原发耐药相关研究进展甚微。.我们对19例新鲜活检标本原代培养并传代成株，发现了具备原发耐药特性的SF-86和化疗敏感的NC-04细胞株，并建立了原发耐药骨肉瘤裸鼠模型（专利号：201010110746X）。.通过对SF-86和NC-04细胞进行全基因组表达谱基因芯片对照分析，初步筛选出50个潜在的原发耐药相关分子，随后建立shRNA慢病毒RNAi文库进行功能验证，发现SKA1基因显著影响SF-86细胞对多种化疗药物的耐药功能，提示SKA1基因在骨肉瘤原发耐药中起重要作用，而目前未见相关报道。.本项目观察了SKA1基因稳定沉默的SF-86，U2OS和Saos-2细胞株的耐药变化，发现SKA1基因稳定沉默后，SF-86细胞的耐药性明显消失，恢复了对MTX，DDP和ADM的敏感性，而U2OS及Saos-2的药物敏感性也有一定的增加。同时，SKA1基因稳定沉默后，SF-86，U2OS及Saos-2细胞株的增殖和侵袭力都显著降低。酵母双杂交实验发现SKA1基因能够和转录复合体II的亚单位RPB3结合。随后我们进行了免疫共沉淀实验进一步验证，发现在SF-86细胞中，SKA1基因确实能够和转录复合体II的亚单位RPB3发生内源性结合。我们再用染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）的方法，深入研究SKA1、RPB3和FBGS基因之间的关系。发现，MTX治疗时，RPB3蛋白能够结合到FPGS基因的启动子区域，而高表达SKA1基因时这种结合被抑制；而SKA1蛋白本身并不能结合到FPGS基因的启动子区域，这说明，MTX的原发耐药机制在于，SKA1基因高表达时，抑制了RPB3和FPGS基因的启动子区域的结合，从而抑制了MTX作用于细胞时，细胞应该启动的FPGS表达增加，因此不能合成能够滞留在细胞内的MTXPG，细胞内的MTX浓度无法达到有效地杀伤浓度水平。至此，本项目基本阐明SKA1基因在MTX原发耐药中的作用及其分子机制。