基于线粒体基因组的粘体动物进化与系统发育研究

粘体动物是一类泛在的产孢子动物，作为水产动物的重要病原而广为人们所知，迄今已报到2500余种。因适应寄生生活导致的形态结构退化，学界对其起源、现存种类多样性进化、分化及扩散等进化与系统生物问题存在很大争议。基于核基因组或线粒体基因组的比较基因组学已广泛运用于动物起源与进化研究，而粘体动物是在门阶元缺乏线粒体基因信息的唯一动物类群。本项目拟测定基于核基因（小核糖体RNA）构建的粘体动物系统发育树中几个关键节点物种的线粒体全基因组序列，应用其蕴含的丰富序列及组织结构信息探讨粘体动物的起源、进化、系统发育关系及寄生生活对其线粒体基因组进化的影响等进化生物学问题。并尝试应用线粒体基因组不同序列或结构信息开发适合其门内各阶元系统发育关系研究的分子标记，补充并佐证现有基于形态及单一核基因构建的粘体动物系统发育关系。

线粒体基因组是研究动物系统进化的最常用分子标记之一，而粘体动物是现行缺乏线粒体基因（组）信息的唯一门阶元的类群。项目经过三年多的试验，取得如下结果：1）在比较不同裂解与基因组抽提方法的基础上，发展了粘体动物孢子线粒体基因组抽提方法，即利用MP公司的FastPrepTM-24细胞破碎仪裂解孢子，再用Fast DNA for soil试剂盒抽提，可获得较高质量的粘孢子虫线粒体基因组；2）利用脉冲电泳技术初步测定了吴李碘泡虫的线粒体基因组为费环形结构，但尚不能确定其有几条线性染色体构成；3）在尝试百余对真核生物线粒体各基因引物后，发现使用刺胞动物钵水母亚纲某些种的线粒体基因引物可扩展出吴李碘泡虫、武汉单极虫、吉陶单极虫与萨氏角形虫的细胞色素氧化酶亚单位1(cox1)，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位2与5（nad2,nad5）及线粒体小核糖体RNA亚单位（rns），其中吴李碘泡虫与萨氏角形虫的cox1基因全长分别为1048bp与1326bp，GC含量分别为49%与47%，起始密码子分别为ATG与GTG；4）利用获得的四种粘孢子虫的cox1、nad2、nad5与rns基因串联拼接基因序列或氨基酸序列建立的系统发育树得到大致相似的拓扑结构，即所有粘体动物位于刺胞动物内，与钵水母亚纲形成姊妹群，支持了来自核基因组关于粘体动物是自由生活刺胞动物早期祖先适应寄生生活而进化的一退化类群，但由于序列差异较多，粘体动物与珊瑚纲的系统发育关系依然不明。但必须指出，项目执行至今虽然我们拿到了部分粘体动物线粒体基因，但距离项目完成获得粘体动物5种关节节点物种的线粒体全基因组还有相当长的距离，在我们开始这个项目后，欧洲粘体动物研究中心捷克寄生虫研究所的Ivan Fiala博士及以色列特拉维夫大学进化研究学家Huchon Dorothee博士也先后开展了粘体动物线粒体基因组的研究工作，但至今未能得到一个粘体动物的完整线粒体基因组，考虑到粘体动物线粒体基因组可能是多线性结构，我们一致认为后续研究需要采用高通量测序结合单细胞测序技术以获得更丰富的粘体动物线粒体基因组信息。本项目预计的研究内容是个系统性工作，项目执行至今仅仅是为后续工作开展积累了经验，前路漫漫。