酸环境胁迫下乳酸菌谷氨酸脱羧酶应答机制和功能改造研究

研究以Lactobacillus brevis CGMCC 1306谷氨酸脱羧酶（GAD）为模型，针对乳酸菌GAD的生物学功能及其GAD基因表达调控这一研究热点，拟在大量前期研究的基础上，运用分子生物学、生物信息学的方法，研究GAD操纵子中各相关基因的功能及基因间的相互作用机制，寻找和鉴定对转录表达起关键调控作用的作用因子，明确GAD基因表达、活性调节的代谢调控信息和相应的信息触发、传递和调节机制，阐明GAD在乳酸菌中的生物学功能及其应答酸性pH胁迫的表达调控机理和抗酸机制。通过对GAD在酸性pH环境胁迫下功能改造研究，引入GAD基因改造或修饰已有的代谢途径或构建新的代谢途径，以期实现对乳酸菌等工业生产菌株进行生理功能的工程改造，提高工业微生物在酸性环境的存活率和对酸性环境胁迫的鲁棒性和适应性，并利用关键基因的表达调控机理为分子育种提供新思路和理论依据，也为工业化生产γ-氨基丁酸提供基础。

采用分子生物学、生物信息学的方法，对短乳杆菌中谷氨酸脱羧酶（GAD）基因的表达与活性调控机理与乳酸菌耐酸机能间的关系进行了研究，通过比较分析不同乳酸菌GAD基因的启动子序列，结合相关实验分析，发现了一个新的GAD基因操纵子，通过克隆测序，识别了相关基因（包括启动子、调节基因、GABA 反向转运蛋白基因等）的序列，确定了完整的操纵子结构，并从 mRNA 水平、蛋白水平和细胞生理水平研究了相关基因的功能及相互关系、各相关基因对乳酸菌的耐酸能力影响，分析了酸胁迫下 mRNA 转录－酶活－耐酸之间的关系，解释了反式作用因子在酸胁迫下调控 GAD 基因表达水平的机理，初步阐明了了 GAD 基因表达与菌体耐酸能力之间的确切关系。此外，通过蛋白质工程手段获得了耐酸性提高的GAD突变酶，扩展了酶的pH 适应范围、提高了其催化活力，并对突变酶性质变化的分子机理进行了分析。通过对GAD 进行分子改造，并采用多种代谢工程手段，提高了乳酸菌株在酸性环境的存活率和对酸性环境胁迫的鲁棒性和适应性，并利用GAD工程菌实现了γ-氨基丁酸（GABA）的高效生物制备。本研究不仅为利用关键基因的表达调控机理进行平台微生物的性能改造提供了新思路和理论依据，也为利用生物方法进行γ-氨基丁酸的工业化生产做好了准备。