基于微生物耐酸响应的定向诱导强化厌氧产氢产酸及其进化驱动机制研究

Fermentative hydrogen production suffers from low hydrogen yield and productivity primarily due to organic acid inhibition and by-product production when treating high concentration of organic matter. However, in view of potential effects of the acid tolerance response (ATR) on hydrogen evolution, hydrogen production could be enhanced by improving acid tolerance capability in mixed cultures via adaptive evolution for their better adaptive capacity. Hence, the microbial ATR in mixed cultures would be directedly induced via cascade adaptive evolution, by which the acid tolerance capability in mixed cultures would be improved and the competitive pathway would be suppressed. Furthermore, the endogenous and exogenous driving mechanism in mixed cultures during adaptive evolution would be revealed by many advanced techiques, such as metaproteomics, PCR-DGGE, RT-PCR-DGGE, qRT-PCR, CLSM and so on.Finally, the enhanced hydrogen and organic acid production would be coupled with methane production to further improve the biomass energy yield.. Research results could contribute to enrich the connotation of oriented reinforcement of fermentative hydrogen and acid production, which could also provide a novel technique to enhance the biomass energy production.Therefore, the project should have a good research value.

利用高浓度有机物高效产氢产酸的关键在于如何在有效解除有机酸反馈抑制的同时实现定向产氢产酸。有鉴于此，本课题以厌氧污泥为研究体系，采用生化工程和级联进化策略，对厌氧污泥中微生物菌群的耐酸响应进行定向诱导，其目的是在赋予厌氧污泥稳定酸耐受能力的同时弱化其产氢过程中的竞争途径，从而在高浓度底物转化条件下实现定向强化产氢产酸；同时课题借助多种技术手段，包括宏蛋白质组学、PCR-DGGE、RT-PCR-DGGE、qRT-PCR以及荧光标记-CLSM等技术对整个厌氧污泥体系多维水平的内外源进化驱动机制进行深层次的揭示；在此基础上将定向强化产氢产酸与高效产甲烷技术相耦合，强化高浓度、高有机负荷下的生物质能转换效率。.本项目研究成果有助于丰富和充实有关定向强化产氢产酸的内涵，同时可以为生物质能的高效生产提供新的技术手段，因此具有较好的研究价值和应用前景。

微生物异质性是影响混合菌群发酵效能的主要因素。有鉴于此，本课题采用适应性进化策略，通过调控产氢菌群的微生物异质性，定向诱导微生物的耐酸响应，以强化其发酵制氢效能。在此基础上，借助多种先进技术手段对产氢菌群适应性进化的生物学机制进行了解析，主要结论如下：.（1）丁酸合成能力的提高是强化混合菌群定向发酵制氢的关键。代谢抑制剂的复合作用可以有效调控产氢菌群的代谢异质性。.（2）以代谢抑制剂和丁酸胁迫作为复合选择性压力，采用级联适应性进化策略可以有效强化产氢菌群的定向发酵制氢能力。hydrogenase 和H+-ATPase 的高活性是强化定向发酵制氢的必要保证，而谷氨酸脱羧酶系统不会对氢气产率造成显著影响。.（3）进化菌群的发酵表现更为稳定，且出发菌群和进化菌群具有截然不同的代谢特征。进化菌群中产醇途径相关酶的比活性相对较低，而产氢产酸途径相关酶的比活性相对较高，而且它们对pH 和丁酸浓度变化的稳定性更好。.（4）随着有机负荷的逐渐提高，进化菌群微生物群落结构的稳定性更好。此外适应性进化前后优势微生物种群发生了一定的演替，进化菌群展现出更高的hydA表达水平。.（5）辅因子水平的差异也可以较好地阐释定向强化发酵制氢的内涵。进化菌群中ButyrylCoA/CoA 的增加可以促进丁酸生成，同时NADH-ferredoxin reductase 的高活性和Ferredoxin-NAD reductase 的相对低活性则可以保证电子经由产氢得以释放；而NADH/NAD+、ATP 以及AcetylCoA/CoA 的相对稳定，则意味着进化菌群中的产氢菌能够有效通过定向发酵制氢途径以保证胞内的生理平衡。.（6）经过适应性进化后，产氢菌群分泌EPS能力更强，形成了更为致密和稳定的污泥生物相结构，且其宏蛋白质组发生了显著演替。.本项目研究成果有助于丰富和充实有关混合菌群定向发酵制氢的内涵，同时可以为生物质能的高效生产提供有益思路。