产ε-聚赖氨酸枯草芽孢杆菌的耐酸进化驱动机制

Unknown about the regulation mechanism of ε-poly-L-lysine (ε-PL) biosynthesis is the limiting factor for rational regulation of ε-PL-producing strains through genetic modifications. Environmental pH is the most important factor for ε-PL biosynthesis, moreover, the production of ε-PL is dependent on acidic pH. In our previous study, pH3.0 was found to be more suitable for ε-PL synthase expression, and that short-term stress by pH3.0 would cause the global response of mycelia to markedly enhance ε-PL production. It is deduced that long-term stress on mycelia by pH3.0 could trigger gene mutation, which would certainly promote the production of ε-PL. In this research, Bacillus subtilis YX-7, an ε-PL-producing bacterium, was used as the original strain, and a high-yield strain was obtained by adaptive evolution at pH3.0. The microbial physiology, transcriptomics, proteomics and gene engineering were employed to illustrate the promotion mechanism of acidic adaptive evolution for high ε-PL production at levels of intracellular microenvironment, gene transcription and expression. Furthermore, analysis on the function of key trans-acting factors would disclose the regulation mechanism of ε-PL biosynthesis. The research would help to understand the dependence of ε-PL production to acidic pH, which could also provide theoretical guidance for construction of desired metabolic engineered ε-PL-producing strains.

ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine, ε-PL）生物合成调控机制的未知是制约生产菌理性改造的限制因素。环境pH是影响ε-PL生物合成的关键，且ε-PL合成对酸性pH存在依赖性。申请人前期发现：pH3.0更加有利于ε-PL合成酶的表达，短时pH3.0胁迫能够引起细胞的全局响应从而大幅提高ε-PL产量。由此推断，通过长时间pH3.0胁迫菌体，进而引起基因水平的改变，必定能够提高生产菌的ε-PL合成能力。本项目以一株生产ε-PL的枯草芽孢杆菌YX-7为原始菌株，通过pH3.0耐酸适应性进化得到高产菌株。采用微生物生理学、转录组学、蛋白组学以及基因工程手段，从胞内微环境、基因转录和表达层面阐明耐酸进化促进ε-PL合成的生理机制，并解析关键反式作用因子的功能，从而揭示ε-PL生物合成的调控机制。本项目有助于理解ε-PL合成对酸性pH的依赖性，并为ε-PL生产菌的代谢工程改造提供理论指导。

本项目以从土壤中筛选到的产ε-聚赖氨酸的链霉菌为研究对象，通过pH3.1的环境胁迫进行酸性适应性进化得到高产菌株，采用微生物生理学、转录组学以及基因工程的方法考察原始菌株和进化菌株之间的差异，最终揭示了酸性适应性进化的驱动机制。主要结论如下：.（1）酸性适应性进化能够提高ε-PL产生菌的耐酸能力。与原始菌株相比，进化菌株在pH5.0，4.5和4.0的固体平板中菌体生长以及产孢子速度更快，在pH4.0的条件下摇瓶发酵后的菌体干重更多，且在pH3.0的条件下胁迫48h的存活率更高。.（2）酸性适应性进化能够提高ε-PL产生菌的ε-PL合成能力。在摇瓶发酵和5L发酵罐维持pH3.8分批发酵过程中，进化菌株的ε-PL产量和产率更高，且采用酸性pH冲击工艺在5L发酵罐中进行补料-分批发酵，发酵192h，进化菌株Streptomyces albulus AAE89的ε-PL产量达到45.8g/L，产率为5.73g/L/d，比原始菌株S. albulus QLU58提高了57.06%。.（3）ε-PL产生菌酸性适应性进化的驱动机制。与原始菌株相比，酸性适应性进化得到的进化菌株在酸胁迫条件下能够在胞内保持更高的ATP浓度和H+-ATPase活力，积累更多的天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸以及脯氨酸，从而使胞内pH（pHi）维持在较高水平；同时，进化菌株中细胞膜脂肪酸的不饱和度升高，从而增强了细胞膜的流动性。这些变化减轻了酸胁迫对菌体的损伤。此外，SigE控制下上调的hrdD和激活的MprAB和PepD信号转导系统共同导致了pls的上调，伴随着细胞内ATP、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸的积累和适合的胞内pHi，ε-PL的合成最终被促进。.本项目对于揭示ε-PL产生菌的耐酸能力和ε-PL合成能力之间的关系具有重要意义，也为利用代谢工程改造ε-PL产生菌提供理论指导。