影响果蝇多酚氧化酶铜螯合和活性的结构位点解析

昆虫多酚氧化酶（PPO）属于类型3含铜蛋白，对昆虫天生免疫有重要调控作用，并且影响昆虫的正常生长发育。PPO能够氧化降解有毒的酚类化合物，在环境保护中有重要的应用前景。前期研究表明果蝇三个PPO在体外重组表达具有不同的理化特征，三者对铜的反应能力不尽相同；重组表达的果蝇活性形式PO并不具有酶活性，类似的其它昆虫PPO即使在激活位点被切割后也不具有活性。这些方面的机理或原因不清楚。通过分析比较果蝇的三个PPO模建蛋白结构和烟草天蛾的PPO晶体结构，发现可能存在一些重要的氨基酸位点影响果蝇PPO和铜的螯合或影响活性口袋中place holder的有效移动而阻碍酶活性的表现。本申请项目将通过氨基酸突变、表达和活性的比较，来验证重要的氨基酸位点对铜螯合能力的影响、或阻碍place holder移动并进而干扰活性的表现，有助于深入认识昆虫PPO的结构和功能的关系，并为将来的环保应用提供理论依据。

昆虫多酚氧化酶对昆虫天生免疫有重要调控作用，昆虫的多酚氧化酶的研究已经延续一个多世纪，随着研究的不断深入，人们对于多酚氧化酶激活通路和调控的了解也日渐清晰，但是对于其深入功能研究停滞不前。随着昆虫多酚氧化酶的晶体结构的解析，使得我们得以深入研究多酚氧化酶蛋白结构和酶活性的关系，为认识其新的功能提供了新的思路。通过本项目的资助我们获得了具有活性的重组多酚氧化酶蛋白，利用这个体系，我们研究发现影响多酚氧化酶和铜的结合位点，及决定活性的重要氨基酸，而多酚氧化酶的两个二硫键不但可以提高酶的稳定性和活性，同时还有助于提高抗菌活性。在完成课题任务的基础上，我们进一步研究发现昆虫多酚氧化酶可以与荧光蛋白融合表达，具有酶活性和荧光特征，同时利用生化手段解析了在体外的独特激活方式。进一步的研究揭示昆虫的前后肠和蜕皮液存在多酚氧化酶，在后肠中多酚氧化酶通过对粪便黑化作用清除可能残存的病原菌，而蜕皮液中的多酚氧化酶对保护刚蜕皮的幼虫至关重要，表明昆虫多酚氧化酶具有新的尚未认识的功能。对昆虫多酚氧化酶相关研究受邀撰写综述，以超越免疫的视野去重新认识昆虫多酚氧化酶的功能。