滋肾清热利湿化瘀方干预PCOS颗粒细胞影响卵泡发育分子机制研究

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common endocrine and metabolic disorder, characterized by chronic anovulation, elevated level of male hormones and metabolic dysfunctions. Our previous study has confirmed that Zi-Shen-Qing-Re-Li-Shi-Hua-Yu-Fang could improve the symptoms of patients with PCOS. In this project, we will firstly determine the therapeutic effect of this prescript on the reproductive endocrine and metabolic system of rat model of PCOS in vivo, then isolate ovarian granulosa cells from PCOS patients and determine whether the improved reproductive endocrine functions of PCOS treated by this prescript was mediated by regulating the function of ovarian granulosa cells; then we will search for Zi-Shen-Qing-Re-Li-Shi-Hua-Yu-Fang-treated associated differentially expressed proteins and corresponding signaling pathway networks using iTRAQ and bioinformatic methods; finally we will select two representative signaling pathways associated with reproductive endocrine and metabolism systems, respectively, to determine their potential roles in the treatment of this prescript on PCOS in vitro and in vivo. These results will help us to better understand the molecular mechanisms of the therapeutic role of Zi-Shen-Qing-Re-Li-Shi-Hua-Yu-Fang on PCOS, and will also facilitate the modern elucidations of “kidney deficiency, and partially was due to presence of phlegm-dampness and blood stagnation”.

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS）是一种常见的内分泌代谢紊乱疾病，以慢性无排卵、高雄激素和代谢紊乱为主要临床特征。我们前期研究已证实，滋肾清热利湿化瘀方能显著改善PCOS患者症状。本项目中我们将在前期工作基础上，从整体动物水平明确该方对PCOS大鼠模型的生殖内分泌和代谢系统的改善作用；分离PCOS患者卵巢颗粒细胞，明确该方能否通过调控颗粒细胞功能而改善机体生殖内分泌功能；利用iTRAQ技术和生物信息学方法，筛选出与该方治疗相关的差异表达蛋白并构建信号通路网络；综合分析后，选择与生殖内分泌及代谢系统分别相关的两条信号通路，在细胞和整体动物水平分别验证其在该方治疗PCOS中的作用。研究结果有助于我们理解该方治疗PCOS的分子作用机制，为相关患者分子靶向治疗提供新思路；也将有助于对PCOS“肾虚为本，湿热痰浊瘀血为标”的虚实夹杂中医病机进行现代诠释。

“ 肾虚为本，湿热、 痰浊、 瘀血为标” 的虚实夹杂病机是PCOS最根本病机。前期，我们临床研究发现滋肾清热利湿化瘀方（简称滋肾方）治疗后，不但能明显降低患者血液中睾酮（T）、胰岛素（INS）和促黄体生成素（LH ）的水平，还能恢复部分患者的有排卵月经周期，总排卵率约为41.4%；并且可显著改善患者的肥胖、痤疮等临床症状。然而，目前对于滋肾方治疗 PCOS 的具体分子作用机制尚不清楚。.因此，本课题的主要研究内容为：运用现代蛋白质组学方法，通过对整体动物和细胞功能分析，对PCOS的中医病机进行现代诠释，以期发现中医药治疗PCOS 的新靶点。.经研究，已完成课题申报的研究目标：.1.动物整体水平方面，证实了滋肾方可改善 PCOS大鼠卵泡发育障碍的作用。.2.通过建立人卵巢颗粒细胞体外模型，经含药血清处理后，运用蛋白质组学技术，筛选出了差异表达蛋白。.3.在经滋肾方干预后的人卵巢颗粒细胞，通过运用RT-qPCR 技术，验证了C/EBPβ、ACAD9等mRNA表达水平有所提高。.4.与对照组含药血清对比，验证了滋肾方可使得C/EBPβ、ACAD9的蛋白表达水平升高。.5.从细胞水平方面，验证了滋肾方通过C/EBPβ信号通路可促进颗粒细胞的增殖。.上述实验，较为全面的完成了课题申报时的科学假说的证明工作。从动物整体水平证明了滋肾方可治疗PCOS大鼠卵泡发育障碍的有效性，研究发现其作用机制在于可改善血T、LH、TG、INS水平及LH/FSH值。同时可改善卵泡及黄体个数情况。通过采用高通量蛋白质组学检查技术，筛选出两组差异表达蛋白进行KEGG通路富集分析，选择出于胰岛素及脂代谢相关的C/EBPβ、ACAD9蛋白通路，并从RNA水平、蛋白表达水平、细胞水平等方面，较为全面地探究滋肾方治疗PCOS的作用机理。