当归拈痛汤调控LncRNA/Fas信号通路诱导RA滑膜细胞凋亡的分子机制研究

Rheumatoid arthritis (RA) is a kind of autoimmune disease with abnormal apoptosis of synovial cells.Based on the earlier research that DangGuiNianTongTang can inhibit the induced inflammatory effect of RA-FLS and protect the synovium of joint, pre-vitro experiment has discovered and verified that LncRNA NR_028371 and multiple effector molecules participate in regulating synovial cell pro-apoptotic protein Fas,so this project proposes the following hypothesis:DangGuiNianTongTang acts on RA-FLS,influences Fas protein expression levels of target gene by upregulating NR_028371, then activates NR_028371-Fas cell apoptosis pathways to induce cell apoptosis and inhibit cell proliferation.The program intends to verify the above hypothesis in the level of cells,animal models and clinical characteristics,which is aimed to discuss the mechanism of action that DangGuiNianTongTang regulates NR-028371/Fas signal pathways and its effector molecules.We are hoping to illuminate the new and noncoding RNA mechanism that DangGuiNianTongTang induces apoptosis,providing experimental basis for the molecular mechanism of interpretating comprehensively that DangGuiNianTongTang induces cell apoptosis of RA synovial cells.The therapeutic effects’ mechanism of DangGuiNianTongTang will be enriched and thingking fields of RA modern pharmachological basis study can be broaden.

类风湿性关节炎（RA）是一种滑膜细胞凋亡异常的自身免疫性疾病，在前期研究当归拈痛汤能够抑制RA-FLS致炎效应，保护关节滑膜的基础上，体外预实验发现并验证LncRNA NR_028371及多个效应分子参与调控滑膜细胞促凋亡蛋白Fas，因此本项目提出如下假说：当归拈痛汤作用于RA-FLS，通过上调NR_028371影响靶基因Fas表达水平，继而激活NR_028371-Fas细胞凋亡通路，从而诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖。本项目拟从细胞、动物模型、临床水平对上述假说进行验证，旨在探讨当归拈痛汤调控NR_028371/Fas信号通路的作用机制，以期阐明当归拈痛汤诱导凋亡作用的非编码RNA新机制，为全面诠释当归拈痛汤诱导RA滑膜细胞凋亡的分子机制提供实验依据，从而丰富当归拈痛汤F防治RA的疗效机理，亦为RA现代药理基础研究拓宽思路。

类风湿关节炎是一种以关节及关节周围组织慢性炎症病变为主要表现的自身免疫性疾病，长期应用西药治疗，毒副作用大，疗效不佳。开发防治RA有效的方法和药物，明确其治疗机制，有重要的科学意义和社会意义。本课题在研究当归拈痛汤抑制RA FLS过度增殖、保护关节滑膜及抑制炎症反应的基础上，进一步探讨了当归拈痛汤在防治RA过程中调控lncRNA NR_028371及其核心靶基因Fas所发挥的作用。由此阐明了当归拈痛汤抗炎免疫作用的非编码RNA新机制，丰富了当归拈痛汤的疗效机理，为当归拈痛汤防治RA提供实验依据，亦为RA现代药理基础研究拓宽思路。实验内容包括：首先用ceRNA芯片技术筛选正常人与RA患者膝关节滑膜组织差异表达的mRNAs、lncRNAs、和circRNAs，再通过KEGG/GO富集分析及凋亡基因数据库等方式找到凋亡相关兴趣分子NR_028371，根据RNAplex等软件分析预测到其靶基因Fas，明确了NR_028371与Fas作为该课题的主要研究对象。动物水平上成功建立了佐剂性关节炎大鼠模型，对各组大鼠足趾肿胀程度、AI评分和病理学变化进行了观察，并检测了NR_028371/Fas及其调控的相关凋亡基因的mRNA和蛋白表达变化；同时在细胞水平，通过MTT、Transell、流式细胞术及JC-1、MDC等实验，我们证实了当归拈痛汤能够显著抑制RA FLS的增殖、诱导其凋亡并降低细胞自噬水平，并通过WB和QPCR检测了NR_028371/Fas及其下游凋亡相关基因、自噬相关基因的mRNA和蛋白表达水平。在分子层面上，通过质粒构建技术和RNAi干扰技术实现NR_028371的过表达和靶基因Fas的干扰实验，检测了分子干预后RA FLS的增殖活力和侵袭能力，并且再次验证分子干预后NR_028371/Fas表达及下游凋亡相关基因的mRNA和蛋白表达水平，将所得结果与当归拈痛汤干预结果相对比。通过上述研究，我们得出当归拈痛汤能够通过调控lncRNA/Fas信号通路诱导RA FLS的凋亡，抑制其过度增生，进而发挥治疗RA的作用。因此本课题以lncRNA/Fas信号通路为着眼点，从动物、细胞、分子水平全面阐明当归拈痛汤防治RA的作用机制。