神经鞘磷脂合成酶2在脑缺血再灌注损伤后炎症反应TLR信号通路中的作用机制

Secondary brain injury is the bottleneck of therapy in cerebral infarction, for which inflammatory damage is one of the main reasons. SMS2 is an important regulatory factor involved in the inflammatory response so that it is essential to explore the underlying mechanism of SMS2 in the inflammatory damage after cerebral infarction.We previously demonstrated the expressions of SMS2, TLR4 were up-regulated in ischemic brain which be decreased by inhibitor of SMS2 signaling, The infarct volume was aslo alleviated by inhibitor.These results suggested that SMS2/TLR4 pathway plays a role in inflammatory damage after cerebral infaction,but it is unknown whether the inflammation response induced by SMS2 is also through other members of TLRs pathway and how.Our research will use SMS2-/- and wild-type mice pMCAO model,and apply our laboraory's mature assessment system of cerebral infarction to explore the correlation between the SMS2/TLRs pathway and inflammatory damage after cerebral infaction, thereby prove the possible physiopathologic machanism of cerebral infarction and then screen the effective medicines which suppress SMS2/TLRS pathway or inflammatory damage.

继发性脑损伤是脑梗死治疗的瓶颈，炎症损伤是其主要原因。神经鞘磷脂合成酶2（SMS2）是炎症反应的重要调控因子，因此探讨SMS2在脑梗死后炎症损伤中的作用机制具有重要意义。申请人预实验结果显示，SMS2与TOLL样受体4（TLR4）在脑梗死后表达上调，给予SMS2阻断剂后，两者表达均抑制，且观察到脑梗死体积减小。由此提示SMS2/TLR4信号通路在脑梗死后炎症损伤中发挥作用，但SMS2和TOLL样受体家族（TLRs）其他成员构成的信号通路与该病理过程是否相关尚不清楚。本研究拟采用SMS2-/-小鼠脑梗死模型，应用本实验室成熟的脑梗死评价体系，探讨SMS2/TLRs信号通路与脑梗死后炎症反应的相关性，并进一步探讨脑梗死的病理生理机制，筛选抑制SMS2/TLRs信号通路及炎症损伤的有效药物。

目的背景：.鞘磷脂合成酶2 （SMS2）是鞘磷脂合成途径中的关键酶，在炎症反应中发挥着重要作用，尤其可影响TLR4/NF-κB通路的激活。 既往研究发现，SMS2缺乏可通过抑制巨噬细胞TLR4/NF-κB通路的激活。此外，研究发现SMS2在脑组织中广泛分布和表达。然而目前关于SMS2对脑缺血再灌注损伤后炎症反应的作用及其机制尚不完全清楚。为此，我们通过小鼠短暂性脑缺血再灌注模型观察SMS2在脑缺血再灌注损伤后的作用及其机制。.主要研究内容：.实验选用8-12周龄的健康雄性C56BL/6野生型小鼠（WT小鼠）及以C57BL/6为背景的SMS2敲除小鼠(SMS2-/-小鼠)为研究对象。 应用线栓法建立的小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型，1小时后拔除线栓实现血流再灌注。分别在手术造模后24小时和72小时，通过神经功能缺损评分， 2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色测定脑梗死体积，观察SMS2缺乏在脑缺血再灌注损伤后的作用；应用 RT-PCR、免疫荧光染色、Western-blot及流式细胞检测的方法，通过检测炎症因子的表达、小胶质细胞的浸润、NF-κB p65的核转位情况及小胶质细胞表面TLR4及TLR4/MD2复合体的表达情况，观察SMS2缺乏对脑缺血再灌注损伤后炎症反应的作用；应用蔗糖梯度离心及液相串联质谱测定的方法，通过检测脂筏区域及非脂筏区域TLR4的表达及鞘磷脂的含量，研究SMS2缺乏在脑缺血再灌注损伤后发挥抗炎作用的机制。.重要结果:.结果显示：在缺血再灌注后72小时，与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠的神经功能明显得到改善，梗死体积显著减小；SMS2-/-小鼠脑组织缺血半暗带炎症因子mRNA水平的表达明显降低，抑炎因子mRNA水平表达明显升高，小胶质细胞的激活减弱、NF-κB的核转位显著减少。同时，SMS2缺乏可减少小胶质细胞表面TLR4/MD2复合体的数量，而对TLR4的含量没有影响，可见SMS2缺乏对TLR4/MD2复合体的形成具有抑制作用。此外， SMS2缺乏可显著减少脂筏区域TLR4的表达及鞘磷脂的含量。.科学意义：.上述实验结果表明，在小鼠脑缺血再灌注后， SMS2缺乏可通过减少脂筏上鞘磷脂的含量，抑制TLR4向脂筏区域的募集，从而减少TLR4/MD2复合体的形成，进而抑制TLR4/NF-κB炎症通路的激活，减轻脑缺血再灌注后的炎症反应，发挥脑保护作用。