异构酶Pin1调控MSK1激酶活性在鼻咽癌变中的作用及机制研究

The peptidyl-prolyl isomerization catalyzed by Pin1 is an essential post-phosphorylation regulatory mechanism in phosphorylation signaling. Abnormal activation of MSK1 has been observed in many human tumors. However, it is not clear whether the activity of phosphorylated MSK1 is regulated by Pin1-mediated isomerization. In our previous study, Pin1 had been shown to directly interact with p-MSK1 and enhanced the activity of MSK1 in nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells. Moreover, there was a significantly positive correlation between Pin1 overexpression and elevated phosphorylation of MSK1 in NPC tissues. Therefore, it is speculated that Pin1 may regulate the activity and function of p-MSK1 by binding to and inducing its conformational changes. In this project, the interaction and binding sites between Pin1 and p-MSK1 will be identified, and the cis/trans isomerization of p-MSK1 mediated by Pin1 will be analyzed. The regulatory role of Pin1 on MSK1 activity will be determined, and its mechanism will be further explored. Furthermore, the effects of Pin1-mediated regulation for MSK1 on histone H3 phosphorylation and AP-1 transcriptional activity will be assessed, and the role of “Pin1-MSK1-histone H3” pathway in carcinogenesis of NPC will be investigated by clinic sample analysis, in vitro and in vivo experiments. All findings will contribute to reveal a post-phosphorylation regulatory mechanism for MSK1 kinase and clarify the roles of Pin1 in NPC carcinogenesis, and provide a novel strategy for NPC treatment.

Pin1的异构作用是蛋白质磷酸化后的重要调节机制。多种肿瘤中都存在MSK1激酶的异常活化，但其磷酸化后激酶活性是否受异构酶Pin1的调控尚不清楚。前期研究发现Pin1与磷酸化MSK1存在直接相互作用，且过表达Pin1能增强鼻咽癌细胞MSK1的激酶活性；在鼻咽癌病例中也发现Pin1的过表达与MSK1高磷酸化呈正相关，故推测Pin1可能是MSK1磷酸化后活性和功能的重要调节因子。本项目拟进一步鉴定Pin1与磷酸化MSK1的相互作用及结合位点；明确Pin1对MSK1激酶活性的调控作用，并探讨其机制；检测Pin1调控MSK1对下游组蛋白H3磷酸化和AP-1转录活性的影响，并通过临床标本分析、体外实验和体内裸鼠实验验证“Pin1-MSK1-组蛋白H3”通路在鼻咽细胞恶性转化中的作用。本项目将阐明MSK1激酶磷酸化后活性调控的新机制，并扩展Pin1多靶点调控鼻咽癌变的分子机制，为鼻咽癌治疗提供新思路。

Pin1的异构作用是蛋白质磷酸化后的重要调节机制。多种肿瘤中都存在MSK1激酶的异常活化，但其磷酸化后激酶活性是否受异构酶Pin1的调控及其在鼻咽癌变中的作用尚不清楚。本研究在生物信息学的基础上，通过免疫荧光染色法、GST Pull-down、免疫共沉淀以及定点突变等鉴定Pin1与MSK1之间的相互作用及结合位点；通过蛋白激酶活性实验、Western blotting以及放线菌酮蛋白抑制法等分析Pin1对MSK1激酶活性、磷酸化水平及蛋白稳定性等的调控作用；通过检测Pin1 和MSK1 激酶在鼻咽癌组织中的表达及相关性以及在鼻咽癌细胞中高/低表达Pin1和（或）MSK1对鼻咽癌细胞表型和下游调控分子的影响揭示Pin1 调控MSK1在鼻咽癌变中的作用。研究结果显示：（1）Pin1与MSK1激酶之间存在相互作用：蛋白质分子对接建模显示Pin1 WW结构域与p-MSK1 Thr581位点之间存在相互作用；激光共聚焦扫描显示Pin1和p-MSK1在细胞核内存在共定位； GST Pull-down和免疫共沉淀实验显示Pin1能与p-MSK1相互结合，其中Thr581位点为关键的结合位点。（2）Pin1介导MSK1磷酸化后激酶活性的调控：在鼻咽癌细胞中高/低表达Pin1可明显影响MSK1对组蛋白H3磷酸化的激酶活性作用及MSK1蛋白表达水平，其机制与Pin1调控MSK1蛋白稳定性有关。（3）“Pin1-MSK1-组蛋白H3”通路在鼻咽癌细胞恶性增殖中起重要作用： Pin1和p-MSK1（Thr581）在鼻咽癌组织中均呈明显高表达，两者呈正相关关系；体外实验结果显示同时下调Pin1和MSK1的表达可显著抑制鼻咽癌细胞增殖和克隆形成能力，并导致下游调控分子组蛋白H3磷酸化水平、c-Jun和AP-1转录活性等的降低；下调Pin1的表达可有效逆转MSK1的促增殖作用。（4）MSK1 Thr581位点磷酸化促进鼻咽癌细胞增殖：将MSK1Thr581位点突变后可有效抑制鼻咽癌细胞的增殖，并可干扰Pin1调控MSK1激酶的促增殖作用。本项目的完成将明确MSK1激酶在鼻咽癌发生发展中的作用，并从Pin1翻译后修饰调控的角度揭示MSK1异常活化的新机制；有助于扩展Pin1多靶点调控鼻咽癌变的分子机制和信号网络，为开展针对异常活化的蛋白激酶的靶向治疗提供新的思路。