基于RNAi技术改良甘蔗品种抗黑穗病性的研究

Sugarcane smut, which is most difficult to control, is one of the most important airborne fungal diseases in sugarcane production, at home and abroad. In this project, because of the difficulty in the conventional cross-breeding of sugarcane varieties, two kinds of experiments were carried out as follows: (1) Based on in silico cloning, conventional PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction, genome walking and rapid amplification of cDNA ends, full-length cDNA and genomic DNA sequences of sugarcane smut resistance related genes and inducing related genes were cloned; (2) Bioinformatics analysis, prokaryotic expression,Real-time PCR, protein subcellular localization, gene transient expression techniques and transformation into mode plants were applied to confirm the function of these smut resistance related genes and inducing related genes and thus ascertainment of disease resistance and inducing key genes The above study aims to provide gene resources for the germplasm creation for sugarcane smut resistance and is expected to provide new knowledge and experiences on a better understanding of the resistance and pathogenesis mechanisms of sugarcane smut disease, the exploitation of disease resistance and inducing key genes and the breeding of smut resistant sugarcane varieties, as well as to provide references on the prevention and cure of fungal disease in other crops.

甘蔗黑穗病是国内外甘蔗生产上最重要且最难控制的一种气传真菌病害。本项目针对常规杂交育种培育抗黒穗病甘蔗品种困难的现实，开展以下两方面的研究：（1）综合利用电子克隆、常规PCR、RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）、基因组步移（genome walking）和cDNA末端快速扩增（rapid amplificatiion of cDNA ends）技术克隆甘蔗黒穗病菌致病或甘蔗抗黑穗病相关基因的cDNA和基因组DNA全长序列;（2）采用生物信息学分析、原核表达、荧光定量PCR、蛋白亚细胞定位和基因瞬时表达技术和遗传转化模式植物鉴定所克隆的甘蔗黑穗病菌致病和甘蔗抗黑穗病相关基因的功能，确定甘蔗黑穗病菌致病和甘蔗抗黑穗病关键基因。以上研究为利用RNAi技术创制抗黑穗病甘蔗新种质的相关研究提供基因资源，有望为更好理解甘蔗抗黑穗病菌的抗性机理和甘蔗黒穗病菌的致病机理、挖掘甘蔗黒穗病菌致病和甘蔗抗黑穗病关键基因奠定基础，从而培育抗黑穗病甘蔗新种质提供新的知识和经验，同时为其它作物真菌病害的防治提供新的参考和借鉴。

甘蔗黑穗病是国内外甘蔗生产上最重要且最难控制的一种真菌病害。本项目针对常规杂交育种培育抗黒穗病甘蔗品种困难的现实，在甘蔗黑穗病菌的全基因组测序及其致病机理解析和利用ISSR和SP-SRAP分子标记技术分析甘蔗黑穗病菌分子多样性的基础上，首先综合利用电子克隆、常规PCR、RT-PCR、genome walking和RACE技术获得了系列甘蔗黑穗病菌致病基因和包括几丁质酶基因在内的甘蔗抗病基因。然后，通过生物信息学分析、原核表达、荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR, RT-qPCR）、蛋白亚细胞定位、瞬时表达和遗传转化烟草等技术，对所克隆的基因进行了功能鉴定。本项目世界上首次完成了甘蔗黑穗病菌的全基因组测序及其致病机理解析。以甘蔗黑穗病菌全基因组序列为基础，从序列注释、共有基因和特有基因、比较基因组学、分类地位和共线性、单倍型和交配型/融合型相关基因组簇、G蛋白偶联受体、碳水化合物代谢相关酶、活体寄生方式、碳源和氮源的利用、致病相关基因、分泌性效应蛋白和次生代谢相关酶基因簇等方面，较为全面地阐述了甘蔗黑穗病菌的致病机理。此外，研究还显示，甘蔗几丁质酶活性与甘蔗黑穗病抗性之间呈正相关。我们还获得了一个Class III几丁质酶基因ScChi (KF664180)。亚细胞定位显示，ScChi定位于细胞核、细胞质和质膜上。RT-qPCR分析表明，ScChi在叶和蔗皮中高度表达。受黑穗病菌侵染后，ScChi在抗病品种中转录水平较感病品种高，且维持时间较长。ScChi同时受SA、H202、MeJA、ABA、NaCk CuCl2、PEG和低温(4°C)胁迫的诱导表达。ScChi瞬时表达后的目标基因的转录水平及6个本氏烟免疫相关标记基因均上调，而过表达pCAMBIA 1301-ScChi的本氏烟叶片中存在高水平的H2O2积累。同时，瞬时表达和转化烟草揭示，ScChi的表达与植物免疫之间关系密切，该基因在甘蔗中是一类与逆境胁迫相关的抗病基因，能积极响应生物和非生物胁迫。以上研究为利用RNAi技术创制抗黑穗病甘蔗新种质的相关研究提供基因资源，有望为更好理解甘蔗抗黑穗病的抗性机理和甘蔗黒穗病菌的致病机理奠定基础，从而为培育抗黑穗病甘蔗新种质提供新的知识和经验，同时为其它作物真菌病害的防治提供新的参考和借鉴。