椰毒假单胞菌酵米面亚种鉴定、溯源技术和数据库的建立

椰毒假单胞菌酵米面亚种是我国学者于1977年发现的一种新的细菌性食源性致病菌，该菌引起的食物中毒在我国平均死亡率达41.80%，而在西方发达国家未见报道。目前，对椰毒假单胞菌酵米面亚种的研究至今仍停留在分类学鉴定、生态学分布、细菌和毒素分离鉴定及中毒诊断标准等传统研究阶段，迄今尚未进行全面的系统发育学研究，也没有建立该菌的分子溯源分析方法，更没有建立相应的溯源分析数据库。本项目拟对椰毒假单胞菌酵米面亚种的生物分型、16S rDNA全序列、脉冲场凝胶电泳、荧光标记扩增片段长度多态性和核糖体分型方法及其指纹图谱进行研究，并建立该菌的鉴定、溯源分析数据库。研究结果将为该菌的鉴定、系统分类提供实验数据，为该菌的流行和分布情况进行积极的主动监测和预警，为该菌食物中毒的散发、暴发事件的追踪和溯源等提供技术依据和科学研究资料。

本研究通过API 20NE、VITEK 2、16S rDNA序列分析对椰毒假单胞菌酵米面亚种分离株进行鉴定，在此基础上使用PFGE、FAFLP、核糖体分型对鉴定明确的菌株进行分子分型，结合菌株流行病学资料建立该菌的溯源数据库。.1. 生化鉴定、培养特征及毒性试验.采用API 20NE与VITEK 2进行生化鉴定和生物分型。API 20NE将93.6%的分离株鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌；VITEK 2将80.8%的分离株鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，16.7%鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌。.对菌株的培养特征和产毒性能进行研究。结果显示银耳液或PD水可保证该菌良好的增殖，并在一定程度上抑制杂菌生长；银耳卵黄琼脂适合对可疑菌株作初步筛选，SS培养基不适合培养特征的描述。对25株分离株进行产毒试验，产毒阳性率较高，与历史数据的比较发现其产毒能力并不恒定，可能与多次传代培养或培养基的改变有关。.2. 16S rDNA序列分析.对78株国内分离株进行16S rDNA序列测定，除2株鉴定为短小芽孢杆菌外，其他76株均鉴定为伯克霍尔德氏菌属，其中74株鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，2株鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌。根据细菌命名原则，应将该菌分类为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。.3. 分子分型分别选择5种限制性内切酶进行PFGE分析，建立SpeⅠ酶切的PFGE分型方法，对76株分离株及4株参考菌株进行分型。.使用4种低频酶与2种高频酶进行FAFLP分析，根据电泳结果选择限制性制性内切酶组合及选择性碱基，筛选出两种方案，建立FAFLP分型方法，对76株分离株及4株参考菌株进行分型。.使用EcoR I和Pvu II，采用DuPont RiboprinterTM系统进行自动化核糖体分型。Pvu II的分辨率高于EcoR I，但均明显低于PFGE和FAFLP。.本研究建立的PFGE与FAFLP方法对椰毒假单胞菌酵米面亚种均具有较强分型能力，各具优点。自动化核糖体分型操作更为简单快速，但价格较高、分辨率较低。.4. 溯源数据库的建立.利用表型特征、16S rDNA和分子分型技术对椰毒假单胞菌酵米面亚种分离株进行鉴定和分型，采用BioNumerics软件进行分析，结合菌株背景信息，建立比较完整的溯源分析数据库。利用该数据技术基础和不断完善的数据库信息，为该菌食物中毒、常规监测中的追踪和溯源