全基因组水平筛选马铃薯干旱响应U-box泛素连接酶基因及其作用机理研究

The ubiquitin/26S proteasome system is one of the most important, highly selective pathway for protein degradation. It is composed of ubiquitin (Ub), ubiquitin-activating enzyme (E1), ubiquitin conjugating enzyme (E2), ubiquitin ligase enzyme (E3) and 26S proteasome. It participates in the regulation of plant species against a variety of abiotic stresses. In the previous study, we found that multiple U-box ubiquitin ligase genes were response to drought stress at the transcriptome level. However, the function and mechanism of those U-box ubiquitin ligases are not elucidated. In this study, the ubiquitinated protein under drought stress of potato will be screened and the U-box ubiquitin ligase gene family members will be identified in the whole genome of potato. In the meantime, the U-box Ubiquitin ligase gene will be screened for drought resistance and the function of U-box gene will be further verified by genetic engineering. At the same time, yeast two-hybrid technique will be used to screen the interaction protein of U-box ubiquitin ligase. We will further analyze the metabolic pathways of U-box and screen proteins in response to drought stress in potato, and analyze the mechanism of U-box and its interacting proteins to jointly control drought resistance of potato. The research will provide a theoretical basis for the genetic improvement of potato drought resistance.

泛素/26S蛋白酶体途径是最重要的、有高度选择性的蛋白质降解途径之一，由泛素分子(Ub)、泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)和26S蛋白酶体组成，参与植物对多种非生物胁迫的调节。在前期研究中，我们在转录组水平发现马铃薯多个U-box型泛素连接酶基因响应干旱胁迫，但其在马铃薯响应干旱胁迫中的功能及其机理并不清楚。本研究将系统筛选马铃薯干旱胁迫下泛素化修饰蛋白，并在马铃薯全基因组中鉴定U-box泛素连接酶基因家族成员，同时筛选抗旱相关U-box泛素连接酶基因，进一步采用基因工程的方法验证U-box基因的功能。同时，以抗旱相关U-box泛素连接酶为“诱饵”，采用酵母双杂交技术筛选与其互作蛋白，并分析U-box及筛选得到的蛋白质在马铃薯中响应干旱胁迫的代谢通路，解析U-box及其互作蛋白共同调控马铃薯抗旱性的机理，为马铃薯抗旱性的遗传改良提供理论依据。

泛素-蛋白酶体系统是细胞内高度特异性的蛋白质降解方式和一种重要的蛋白质翻译后修饰。本研究用K-ε-GG抗体对胰蛋白酶水解后的马铃薯总蛋白进行泛素化修饰肽段富集，用LC-MS/MS技术对泛素化修饰肽段进行鉴定，共检测到泛素化修饰位点314个，分布在200个修饰蛋白上；其中差异修饰位点25个，包括3个显著下调和22个显著上调。在马铃薯全基因组水平共筛选鉴定了66个U-box基因，均含有典型的U-box保守结构域，其中23个含有ARM结构域；66个StPUB基因分布在10条染色体上，且基因结构差异明显，有37个StPUB基因的外显子在2个以上，同时也有29个基因是连续基因。从马铃薯栽培品种“Atlantic”和“青薯9号”中分别克隆得到StPUB27基因，其CDS全长均为2049 bp。构建了组成型启动子CaMV 35S驱动的StPUB27基因的过表达载体和RNAi载体，转化马铃薯获得了转基因植株，StPUB27基因过表达能够加快转基因植株离体叶片失水，过表达植株的叶片拥有更大的气孔导度，StPUB27基因可能参与泛素化修饰调节靶蛋白的活性。从马铃薯栽培品种“大西洋”中克隆得到StRFP2基因，该基因全长CDS 1113 bp，编码370个氨基酸的蛋白，含有典型的RING-H2结构域。构建了StRFP2基因的过表达载体及抑制表达载体，转化马铃薯获得了转化植株。对转基因马铃薯植株的表型分析表明StRFP2基因的过表达能促进马铃薯的生长，而干扰表达抑制其生长。在PEG渗透胁迫下，过表达植株脯氨酸（Pro）含量、过氧化氢酶（CAT）活性、相对含水量均高于WT植株，丙二醛（MDA）含量低于WT植株，而干扰表达植株则相反，这表明StRFP2基因通过改变渗透调节物质来响应干旱胁迫。用酵母双杂交技术筛选出了与StPUB27互作蛋白StUBC56、StPP2C、StSnRK2.5、StF-box和StPolyubiquitin。用双分子荧光互补实验验证StPUB27和StUBC56、StPP2C、SnRK2.5在细胞核和细胞膜中发生互作行使其功能。研究结果可为马铃薯抗旱性的遗传改良提供一定的理论依据。