基于电喷雾萃取电离技术对蛋白质功能成分定量分析

A home-made extractive electrospray ionization technique (EESI) will be used to softly ionize the protein in this proposal, which avoid the destroy of the three dimensional structures of a protein by electrospray ionization (ESI). The native structure of protein can be maintained during the ionization process. Separation and quantitation of dimensional structures of a protein will be obtained by coupling ion mobility spectrometer with extractive electrospray ionization technique. In addition, separation and quantitation of dimensional structures of a protein will be obtained by field flow fractionation in gentle conditions, which can maintain the protein function. Ion cyclotron resonance, field flow fractionation and nuclear megnatic resonance will be used for the analysis of protein-ligand complex to study the relationship between three dimensional structures and function of a protein. The quantitative results about the functional substance of a protein will be validated by using immunology.The key issue on the quantitation of functional substance will be addressed. A novel method about the quantitation of functional substance of a protein will be developed, which will be useful in the field of the public health, food safety, and life science.

本项目拟采用自行搭建的电喷雾萃取电离装置（EESI）对蛋白质进行温和电离，避免常规电喷雾技术对蛋白质三维结构的破坏，在离子化过程中最大程度地保持蛋白质的原始构象。并通过EESI与离子淌度谱的耦合，对蛋白质三维结构体进行分离和定量研究；研究建立条件温和、保持活性的场流分级技术，实现蛋白质三维结构体的分离和定量。采用离子回旋共振质谱、场流分级、高分辨核磁等三种方式对蛋白质-配体复合物进行分析，研究蛋白质三维结构体与功能的关系。采用免疫学方法对蛋白质功能成分定量结果进行验证。最终攻克蛋白质功能成分定量的关键技术，研究建立蛋白质功能成分定量分析的新方法，满足大众健康、食品安全、生命科学等重大领域对蛋白质准确测量的需求。

为实现蛋白质功能成分量的定量分析，本项目自行组装了电喷雾萃取电离技术（EESI），可完成对蛋白质的温和电离，避免了采用常规电喷雾技术对蛋白质三维结构的破坏，可在离子化过程中更大程度地保持蛋白质的原始构象；将电喷雾萃取电离技术与化学砝码耦合，在保持分析速度快等优点的前提下，极大提高了测量结果的准确性；并且基于路易斯软硬酸碱理论，设计了高特异性的离子/分子反应，实现了电喷雾萃取电离技术对海水中二甲硫醚的快速测量。为实现蛋白质三维结构体的分离分析，(a)开发了基于离子淌度分离的新方法，考察了蛋白质在不同离子源温度和脱溶剂气温度下的高级结构变化，研究了不同价态下蛋白质离子的横截面面积计算方法； (b)研究建立了条件温和的场流分离技术，考察了样品进样量、横向流速、聚焦时间、膜材料、缓冲盐浓度、分离腔室厚度等参数对分离效果的影响；(c)自行搭建了场流-质谱联用仪器平台，可实现蛋白质高级结构的分离分析。为实现蛋白质高级结构与功能的关系，采用场流技术实现了抗体亲和力表征的定性与定量；通过分离分析蛋白质聚集体，可实现抗体药物有效性和安全性评价；建立了基于傅里叶变换-离子回旋共振质谱技术结合基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱技术对蛋白质糖基化位点的全面解析方法，通过糖基化位点分析可区分蛋白质的性质和功能；建立了基于纯化的间接定量核磁法、基于氢氘交换的定量核磁法及双信号抑制的色谱-定量核磁法，提高了定量核磁的分离分析能力。本项目的顺利实施，建立了可用于蛋白质功能成分量定量分析的系列新技术、新方法。