基于溶酶体损伤所致自噬通路受阻探讨糖尿病肾病肾脏固有细胞生物学行为异常的发生机制

Autophagy activation is likely to bring the new hope to treat and prevent diabetic nephropathy (DN). However, most of the current related studies mainly focus on the insufficiency of autophagy induction. Our study indicates that the lysosomal dysfunction, in the downstream of autophagy pathway, plays a key role in autophagy inactivation of renal tubular epithelial cells (TECs) during DN. Therefore, we propose the hypothesis that the blocked autophagy pathway caused by lysosome damage is the important internal mechanism underlying abnormal biological behaviors of the renal inherent cells in DN, which could be redressed by protecting lysosome and unchoking the autophagy pathway. By making full use of morden biotechnology, we first explore whether lysosome dysfunction also occurs in other renal inherent cells, which will help to verify the hypothesis that the lysosome dysfunction resulted from lysosomal membrane permeabilization is a universal mechanism underlying autophagy inactivation during DN. Then, we test whether the blocked autophagy pathway due to lysosome damage may fail to degrade some key proteins and then lead to many abnormal biological behaviors related with DN in renal inherent cells, including premature, overproducing extracellular matrix (ECM) and TGF-β1. Finally, we investigate whether autophagic activity recovery through protecting lysosome can redress the abnormal behaviors of renal cells and delay the development of DN. Our study is expected to provide the new thought for better and more reasonable controlling autophagy to treat DN.

调控自噬很可能为糖尿病肾病（DN）防治带来新希望，但现有研究多从自噬诱导不足着手。我们研究发现，溶酶体损伤所致自噬通路下游受阻是导致DN患者肾小管上皮细胞自噬活性不足的关键，因此提出如下假说：溶酶体损伤所致自噬通路受阻是导致各种糖尿病肾脏固有细胞生物学行为异常的内在机制，修复溶酶体并进而疏通自噬通路可纠正肾脏细胞在DN状态下异常的生物学行为。为验证该假说，本研究利用现代生物学技术，首先探讨溶酶体损伤是否也同时累及其它肾脏细胞，以期验证膜透化所致溶酶体损伤是导致DN患者肾脏细胞自噬活性下降的一种普遍机制；接着验证溶酶体损伤所致自噬通路受阻是否因不能降解某些关键蛋白，致糖尿病肾脏细胞出现早衰、过度分泌细胞外基质及TGF-β1等诸多与DN相关的细胞生物学行为异常；最后探讨通过修复溶酶体来恢复自噬活性，能否纠正肾脏固有细胞生物学行为异常，并延缓DN进展。本研究有望为合理调控自噬治疗DN提供新思路。

调控自噬很可能为糖尿病肾病防治带来新希望，但现有研究多从自噬诱导不足着手。我们在前期研究基础上，提出如下假说：溶酶体损伤所致自噬通路受阻是导致各种糖尿病肾脏固有细胞生物学行为异常的内在机制，修复溶酶体并进而疏通自噬通路可纠正肾脏细胞在DN状态下异常的生物学行为。为验证该假说，我们首先以DN患者及AGEs刺激的肾脏固有细胞为研究对象，发现DN状态下LC3-Ⅱ及P62增多，但肾小管上皮细胞及足细胞自噬诱导相关蛋白Beclin1和ATG7等表达水平并未显著增加，说明自噬泡的堆积并非由于自噬诱导增加所致；进一步通过转染tfLC3监测自噬通量以及tunrnover实验，证实DN肾脏固有细胞存在自噬降解明显受阻情况。同时我们观察到DN模型中足细胞、肾小管上皮细胞及系膜细胞溶酶体酶活性及消化能力均显著降低，AO染色、CB与LAMP-1共标记提示其发生了溶酶体膜透化（LMP），进一步应用LMP诱导剂LLOMe等，发现溶酶体促渗剂与AGEs作用相似，从而证实溶酶体膜透化所致溶酶体功能下降是DN肾脏细胞自噬通路受阻的关键节点，也是DN发病的重要节点之一。故而，我们探索有效的溶酶体保护措施，首先通过体外细胞实验证实过表达TFEB基因可以恢复DN所致的溶酶体功能下降，疏通自噬-溶酶体通路，对抗细胞早衰、凋亡等生物行为学异常。其修复自噬-溶酶体通路及防治DN作用也在足细胞HSP70基因特异性高表达的动物模型中得以验证。进而，在此基础上我们筛选出部分药物（白藜芦醇、维生素E、肾炎防衰液、舒洛地特等）通过提高CB、CL活性和DQ-卵清蛋白数量，降低LC3-II和SQSTM1/p62水平治疗DN，说明其可通过修复损伤的溶酶体，纠正糖尿病引起的肾脏固有细胞损伤。综上，我们的研究结果提示通过修复溶酶体来恢复自噬活性，可以纠正肾脏固有细胞生物学行为异常，从而延缓DN进展。上述研究结果已发表SCI论文12篇，中文核心论文4篇。相关成果得到国内外同行认可，受邀为SCI杂志主持专刊1部，部分研究数据为支撑获中华中医药学会科学技术奖二等奖1项。