一个杉木愈伤组织全新miRNA的基本生物学功能及其分子机制研究

Callus induction is the prerequisites of adventitious bud induction and somatic embryogenesis. Currently, there is some problems in callus induction of Chinese fir such as low efficiency induction rate, low quality, and the differentiation ability of callus can not persist for long-term. Using high-throughput sequencing technology, we found that the expression of a new miRNA(cln-miRa19) which target genes were the early auxin-responsive SAUR gene family were significantly enhanced. Since the genes from SAUR gene family play an important role in transmitting auxin signal, while auxin plays an crucial role in callus formation. Therefore, we hypothesized that cln-miRa19 may play an important role in regulating auxin signalling during callus formation. In the present proposal, the biological function of cln-miRa19 will be analyzed by using methods of bioinformatics, molecular biology, and coupled with genetics technology, the regulatory relationship between cln-miRa19 and SAUR and its promoter regulatory mechanism will also been examined, and the upstream transcription factors will also been mined, the aim of this study was to elucidate the molecular mechanism of cln-miRa19 in regulation of callus formation both at transcriptional and post-transcriptional. Hence, this will deepening our understanding of the regulatory mechanism of miRNA, and will also providing new clues for artificially regulate callus formation.

愈伤组织诱导是植物不定芽诱导与体胚发生的关键前提。目前，杉木愈伤组织普遍存在诱导效率低、质量差且分化能力无法长期保持的现象。利用高通量测序技术发现杉木愈伤组织形成过程中高表达且表达差异显著的全新miRNA（cln-miRa19）,预测生长素早期应答基因SAUR是其靶基因。因而，我们推测cln-miRa19可能在愈伤诱导过程中对生长素信号转导起重要调控作用。本项目将采用生物信息学、分子生物学及遗传学技术对其进行超表达分析，明确其生物学功能，研究cln-miRa19与SAUR间的调控关系及其启动子调控机制，挖掘其上游转录因子，从转录水平和转录后水平系统阐明cln-miRa19发挥调控作用的分子机制。本项目将深化我们对miRNA调控机制的认识，同时也为人为调控愈伤组织形成提供新线索。

杉木是我国南方重要的造林树种，其每年优良无性系的需求日益增加，而由于杉木愈伤组织质量与分化能力等问题的限制，使得间接器官发生的繁殖方式一直无法在杉木优良无性系繁育方面得到有效应用，在一定程度上限制了杉木优良无性系的繁育。本项目通过miRNA与靶基因的互作机制，miRNA启动子调控机制及miRNA上游转录因子筛选等方面对杉木愈伤组织高表达全新cln-miRa19的生物学功能及分子调控机制进行研究。结果表明，①cln-miRa19和ClSAUR32可互相激活对方表达。表达模式分析结果表明，cln-miRa19和ClSAUR32在杉木愈伤组织形成过程、不同生长素浓度及拟南芥共表达中的表达模式一致，且在共表达分析中，cln-miRa19在共表达植株中的表达量显著高于在单独转化cln-miRa19植株中的表达量。另外，cln-miRa19和ClSAUR32在愈伤组织分裂期表达量最高，在0.5 mg/L的生长素处理下表达量最高。不同组织部位中，二者的表达模式差异较大。②cln-miRa19启动子可受生长素诱导表达。对cln-miRa19启动子的顺式作用元件分析发现，该启动子含有大量种类、功能各异的顺式作用元件，其中以光响应元件、环境胁迫响应元件、MYB结合元件以及植物激素响应元件的种类和数量居多。与GUS的融合表达试验进一步cln-miRa19启动子具有启动GUS基因表达的能力，且外源生长素处理下，GUS基因表达量显著增加，说明外源生长素可显著提高该启动子的启动活力。③cln-miRa19可能受转录因子OBE3、TCP8、生长素响应基因和脱落酸响应基因调控。通过酵母单杂交试验共获得19个cln-miRa19上游调控蛋白，功能注释后发现了一个OBE3蛋白，一个转录因子TCP8，一个生长素响应家族蛋白，一个脱落酸胁迫-成熟蛋白。本项目从转录因子-cln-miRa19-ClSAUR32解析了cln-miRa19的生物学功能及分子调控机制，研究结果有利于了解杉木愈伤组织形成的分子机制，可为最终人为调控杉木优质愈伤组织形成提供理论依据。