杉木未成熟合子胚发育时期影响胚性愈伤组织诱导的细胞分子响应机制

Efficient embryogenic callus induction is the key technology for Chinese fir elite germplasm multiplication by somatic embryogenesis. Previous studies had found that Chinese fir immature zygotic embryo development stage significantly affected the embryogenic callus induction. It is not clear on the cellular and molecular mechanisms for the embryogenic cells induction effected by different explants. The further study of this problem is of great significance to improve Chinese fir somatic embryogenesis. This project intends to induce embryogenic callus with the explants of 3 development stages of Chinese fir immature zygotic embryos. During in the induction process, the cellular responding mechanism of embryogenic induction difference effected by zygotic embryo development stages will be conformed though the observation of changes occurred in zygote embryo shape, tissue microstructure and ultrastructure. The transcriptome response characteristics of embryonic induction in immature zygotic embryos will be detected by the technology of RNA-Seq, and the key genes about embryogenic cell formation will be excavated. Subcellular localization of key genes will be conducted, and then detect the expression characteristics of key genes on the level of mRNA transcription and protein by qRT-PCR and Western Blot. The tissue-specific expression analysis of key genes will be conducted by in situ hybridization. Genes interaction with key gene will be screened by yeast hybrid system. Eventually, the cellular and molecular response mechanism for Chinese fir relatively younger zygotic embryo easier to the induction of embryogenic callus will be revealed.

高效的胚性愈伤组织诱导是利用体细胞胚胎发生技术实现杉木良种扩繁的关键。前期我们研究发现，杉木未成熟合子胚发育时期显著影响胚性愈伤组织诱导。外植体材料的不同影响细胞胚性诱导的细胞及分子机制尚不清楚，这个问题的深入研究对提高杉木体细胞胚诱导具有重要意义。本项目拟对3个发育时期的杉木未成熟合子胚进行胚性愈伤组织诱导；诱导过程中，通过观察分析合子胚外观形态、组织细胞显微及超微结构的变化，明确不同发育时期合子胚胚性诱导差异的细胞学响应机制；利用RNA-Seq技术研究未成熟合子胚胚性诱导的转录组响应特征，挖掘胚性细胞形成的关键基因；对关键基因进行亚细胞定位，并借助qRT-PCR与Western Blot从mRNA转录和蛋白质水平检测关键基因表达特征，运用原位杂交技术分析关键基因组织表达特异性，酵母双杂交系统筛选关键基因的互作基因；最终揭示杉木较为幼嫩的合子胚易于胚性愈伤组织诱导的细胞学及分子响应机制。

以杉木裂生多胚期合子为材料，研究了9个母本无性系、2种接种方式、4种基本培养基对胚性愈伤组织诱导的影响，发现母本基因型显著影响愈伤组织诱导，无性系S5胚性愈伤组织诱导率最高，达到了17.65%，基本培养基BM最适宜胚性愈伤组织诱导。.以母本基因型S5的3个发育时期（裂生多胚期、器官分化期、子叶胚期）合子胚为外植体进行胚性愈伤组织诱导，在诱导后的3个关键阶段（合子胚肿胀期、胚性愈伤组织初始形成期、胚性愈伤组织增殖期），进行表型和组织细胞结构观察。研究发现，未成熟合子胚在胚性愈伤诱导过程中响应植物生长调节剂的表型及组织细胞变化差异明显。相比其它两个时期，裂生多胚期合子胚组织幼嫩，能够快速响应植物生长调节剂，合子胚胚柄外围细胞在诱导时结构很快变得松散、发生物理分离并转变为细胞质密集、无液泡、富含淀粉粒、核仁大的胚性细胞。.转录组数据显示，裂生多胚期基因表达丰度大于其它发育时期以及胚性愈伤组织诱导的几个时期。裂生多胚期合子胚特异表达基因显著富集到核糖核蛋白复合体等功能条目，以及氧化磷酸化、糖解与糖代谢合成等代谢通路，表明裂生多胚期合子胚细胞活性高、细胞分裂以及发育旺盛。差异基因分析发现，随着合子胚成熟，组内差异基因数量逐渐增多，子叶胚期胚性愈伤诱导过程中差异基因数量最多。.WGCNA分析识别出2个与愈伤组织形成及胚性诱导显著关联的模块。模块antiquewhite4在诱导初期（5d）基因上调明显，随着诱导时间的延长逐渐降低，对应的相关系数前10的基因调控网络识别出基因ZIP5、JAL19、RNALX、Unigene0005991等8个基因连通性最高的枢纽基因，这些基因很有可能参与胚性的起始诱导。与之相反，模块floralwhite在胚性愈伤组织诱导阶段逐渐升高。WGCNA分析识别出HSP70、RBCS等7个与模块表达特征最相关基因，这些基因很有可能参与胚性保持增殖。筛选出WOX2、BBM、MADS3、SPCH、MYB32、ARF2A等多个转录因子为杉木胚性诱导关键基因，AGL15、MADS17、MYB5、SOC1、WIP3、BLH2等多个转录因子为愈伤组织脱分化、胚性愈伤组织增殖关键基因。.