杨树CEP1类半胱氨酸蛋白酶参与木质部细胞分化和程序化死亡的分子机制研究

Cysteine proteases are intimately involved at control points by activates other member proteases, cause the destruction of various cellular targets, leading to cell death. Wood forming is the progress of xylem cell differentiation, programmed cell death and construction of secondary xylem.To understand the mechanism for cysteine protease in xylem differentiation and PCD progress in Populus, four the CEP1-like types of cysteine protease participated in xylem differentiation and PCD progress in Populus would be analyzed. The expression of four CEP1-like cysteine protease in the progress of xylem development would be analysis by in situ hybridization. The enzyme activity would be analysis after expression and purity in E.Coli. At last, the role of cysteine protease participated in xylem differentiation and PCD progress would also be analysis by loss or over-expression technology. It would be used to more undestand the molecular mechanisms of wood forming.

半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease，CP) 通过激活自身酶活性，以及其他蛋白酶、核酸酶的活性来启动并执行植物细胞自发进行的程序化死亡（PCD）过程。树木木材形成过程是木质部细胞自发进行程序化死亡（PCD）的过程。本项目以杨树为材料，在分析毛白杨木质部、韧皮部、根、叶、芽等部位转录组芯片数据的基础上，分析出可能在杨树木质部细胞程序化死亡（PCD）过程起重要过程的4个半胱氨酸蛋白酶基因。通过原位杂交、GFP荧光定位等技术进一步分析这些基因在杨树木质部发育各阶段中的表达、运输和分布规律；同时利用原核表达技术，研究该酶的生化特性与功能；最后通过转基因技术在杨树体内过量或缺失表达这些半胱氨酸蛋白酶基因，进一步分析这些基因的过量或缺失表达对杨树木质部发育的影响；从而全面阐述杨树半胱氨酸蛋白酶基因参与杨树木质部发育与木材形成过程的表达与调控机制，为林木木材形成与品质控制提供理论基础。

本研究分别克隆获得5个毛白杨 CEP1类半胱氨酸蛋白酶基因，完成了基因结构与系统进化关系等问题的分析，结果显示它们全部属于木瓜蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶，且PtCP1属于AALP亚族；PtCP2和PtCP4属于RD19A亚族，PtCP3和PtCP5属于CTB3亚族；利用定量PCR技术、GFP荧光等技术分析了半胱氨酸蛋白酶在组织水平和细胞水平的表达定位，5个基因在毛果杨的根、茎、叶部位均有表达，但是在不同部位中的表达水平存在明显差异。PtCP1主要在叶中表达，PtCP2主要在毛果杨的叶中表达，根次之，在茎中表达量最低；PtCP3主要在毛果杨的叶中表达，根次之，在茎中表达量最低；PtCP4主要在毛果杨的根部表达，叶次之；PtCP5主要在毛果杨的叶中表达，根次之，在茎中表达量最低；利用原核表达技术在体外研究这些酶的生化特性与功能，结果显示PtCP1酶原为37KDa，可以在酸性条件下自激活成为21kDa的成熟蛋白，具有半胱氨酸蛋白酶活性，以酪蛋白为底物测定米氏常数Km=32.18±1.66 μg/mL，最大反应速度Vm=5105.8±407.3 μg/mL/min。在pH3.0、温度37℃时具有最高活性，而PtCP2、PtCP3、PtCP4和PtCP5不能在酸性条件下自激活；利用转基因技术，分别在拟南芥、杨树中过量或缺失表达这些基因，并分析和转基因植株的表现和木质部发育特点，结果发现CEP1直接参与PCD期间细胞组分的清除，并在木质部发育过程中调节次生壁的增厚。该结果也同时解释了γVPE可以激活CEP1，且γvpe突变体中纤维细胞PCD延迟和次级纤维细胞壁增厚；本研究探讨了毛白杨5个半胱氨酸蛋白酶在木本植物木质部PCD和次生壁形成过程中的作用，为林木木材形成与品质控制提供了理论基础。