基于水稻染色体单片段代换系的单株有效穗数QTL qPN1的克隆和功能分析

随着我国人口的持续增加、可耕地面积和自然资源的减少以及环境的不断恶化，我国第一大作物水稻的高产育种显得越来越迫切。水稻理想株型结合分子设计育种是提高产量的一条重要途径，产量相关基因的鉴定、定位、克隆和功能等遗传信息的获取则是高产分子设计育种的基础。本研究组在前期工作中，从籼稻广陆矮4号为受体，粳稻日本晴为供体的染色体片段代换系群体中鉴定出一个控制水稻单株有效穗数的主效QTL qPN1，并完成其精细定位。本项目拟在已有的研究基础上，确定qPN1的候选基因，并利用互补实验进行验证；通过近等基因系、互补转基因株系、过表达株系和RNAi株系研究qPN1的功能及其与产量形成的关系；利用生物信息学分析qPN1基因结构域(domain)；通过测序明确目标qPN1在不同水稻高产品种中的分布，为分子标记辅助选择育种提供相关信息，探明qPN1调控穗数形成的分子生物学机理，为进行水稻分子改良提供重要基础。

本研究在利用染色体片段代换系及其衍生分离群体对一个控制水稻有效穗数主效QTL qPN1精细定位的基础上，通过测序分析确定了qPN1的候选基因，构建了相关载体，通过转基因进行基因的功能验证，并开展了基因的表达分析。取得的主要结果如下：.1、在以前的实验中，qPN1基因已经定位于第1染色体的BAC克隆AP004330和AP003272的重叠位置上，物理距离为34.4kb，在这个区间范围内共有6个候选基因。通过对其测序比对分析，在LOC_Os01g70550基因的第4个外显子处发现碱基的改变，位于碱基1220处的GTG变为了GCG，氨基酸由缬氨酸变成了丙氨酸，在1238碱基的位置CCA变成了CGA，氨基酸由原来的脯氨酸改变为精氨酸。因此，把LOC_Os01g70550确定为候选基因，该基因编码1个N-acetyltransferase。.2、通过农杆菌介导的方法，获得了qPN1互补表达载体的转基因株系。性状调查发现转基因植株在表型上与对照相比有明显差异，具体表现为转基因植株具有较多的分蘖和较高的株高。因此，qPN1基因对水稻株型和产量构成因子起着重要的调控作用。.3、构建了qPN1基因的RNAi载体，并通过农杆菌介导的方法将pRNAi-qPN1转入到受体广陆矮4号，成功获得了转基因株系。对转基因植株和未转基因植株进行农艺性状调查比较发现，导入pRNAi-qPN1的转基因植株单株穗数明显减少，株高显著降低。.4、筛选水稻突变体库，获得TOS17（NE8547）插入突变体。该突变体表现株高明显矮化，单株穗数显著减少。野生型平均株高为68.68±3.78cm，而NE8547突变体为57.60±3.98cm，比野生型降低16.1%；野生型平均有效穗数为14.16±4.23个，而NE8547突变体为9.55±2.44个，比野生型减少32.6%。至此，我们认为LOC_Os01g70550就是qPN1基因.5、为了研究qPN1基因表达的时空特异性，分别提取了野生型广陆矮4号茎、叶、穗和根的总RNA，用于RT-PCR和qPCR实验。结果表明，qPN1基因为组成型表达，但在叶片中表达相对较高，约为其它组织的2-3倍。抽穗期进行GUS 染色，GUS 染色的结果和定量RT-PCR的结果基本吻合，茎、茎节、根、叶、小花中均检测到GUS活性。